表皮调节素、上皮有丝分裂原和干细胞因子对山羊精原干细胞增殖的影响

李 浩，方 乾，任 发，代贵超，王立强，胡建宏

(西北农林科技大学 动物科技学院， 陕西 杨凌 712100)

精原干细胞(SSCs)的研究对于畜牧生产有着重要的意义，但是因其细胞数量较少以及增殖较慢，严重制约了SSCs的相关研究[1]。而细胞因子的添加能够调节SSCs的增殖、分化以及细胞功能的维持[2]。通过研究相关细胞因子对SSCs在体外培养过程中的影响，对于进一步改进SSCs体外长期培养体系有着重要意义。

表皮调节素(Epiregulin)作为表皮生长因子家族中的成员之一，能够促进多种组织细胞DNA合成，可以通过P13K/AKT等通路调节血管内皮细胞的激活、增殖、迁移，促进炎症反应、组织修复和调节卵母细胞发育[3-6]。目前关于Epiregulin对精原干细胞的影响的相关研究较少，仅有Shiraishi等发现其在精子发生受阻的曲细精管中发生非显著上调[7]，而Epiregulin对SSCs在体外培养过程中的影响尚未有相关研究。上皮有丝分裂原(Epigen)作为一种表皮生长因子受体的配体，能够激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和表皮生长因子受体激酶蛋白1(c-ErbB-1)的磷酸化发挥促分裂作用[8]，从而调节细胞的生长增殖和迁移活动[9]。Epigen在小鼠睾丸和肝脏组织中的表达显著高于其他组织[10]，但目前尚未有相关研究揭示Epigen在睾丸组织细胞中的功能。干细胞因子(SCF)是能够与c-KIT受体(CD117)结合的细胞因子[11]，能够调控血细胞的生成、精子发生和黑色素生成，可以引导原始生殖细胞(PGCs)、精原细胞和原始卵母细胞的细胞迁移活动[12]。而相关研究表明，SCF在胚胎干细胞、PGCs、生殖干细胞的自我更新和分化过程中也起着关键的作用[13-14]。

一些能够在体外培养过程中调控SSCs增殖的细胞因子例如GDNF、bFGF等，目前已经得到较深入的研究，但是SSCs增殖慢的问题仍未解决[1-2]。因此发现其他能够调控SSCs增殖与分化的细胞因子具有重要意义。本研究在添加Epiregulin、Epigen和SCF的情况下，对山羊SSCs生长曲线、细胞活力进行检测。以揭示其对山羊SSCs在体外培养条件下的作用，为其他哺乳动物的SSCs长期体外培养体系提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验山羊睾丸采自陕西富平某奶山羊专业合作社，睾丸采自6只60～70 d的关中奶山羊，采集山羊睾丸表面消毒后置于含有5 % 青链霉素双抗的PBS中，并储存在冰盒内，并于2 h 之内运回实验室。

1.2 山羊精原干细胞提取与富集

在超净台内消毒睾丸表面后放置于10 cm 一次性培养皿中，剥离睾丸鞘膜、附睾、白膜，剪去中心部分的结缔组织，将剩余睾丸组织剪成小于1 mm2的组织块。组织碎块用含100 IU/mL 双抗的PBS冲洗三次。使用2 mg/mL IV胶原酶和2 mg/mL的透明质酸酶，37 ℃震荡消化组织25 min。消化后使用PBS重悬并使其自然沉降1～2 min，吸取有悬浮曲细精管组织上清液，重复5～10次。离心收集曲细精管碎片，使用0.25%胰酶消化后收集细胞。

收集细胞接种于多聚赖氨酸处理过的一次性培养皿中，于37 ℃、5 % CO2的细胞培养箱中差速贴壁2 h，重复3次。收集未贴壁细胞接种于含有山羊成纤维细胞饲养层的6孔板中，使用SSCs基础培养基(High Glucose DMEM、1% FBS、1% 青链霉素、1% 非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺、0.1% 2-巯基乙醇、20 ng/mL GDNF、10 ng/mL bFGF以及10 ng/mL LIF)进行培养。

1.3 山羊精原干细胞的鉴定

对富集前后的SSCs进行CD9、GFRA1免疫荧光鉴定。细胞汇合度达到50%左右时，用PBS浸洗3次后用4%的多聚甲醛固定15 min。PBS浸洗3次洗去剩余多聚甲醛，使用0.5 % Triton X-100 20 ℃通透20 min。通透后的细胞使用山羊血清，20 ℃ 封闭30 min。封闭完成后加入一抗4 ℃孵育过夜。次日用PBST 浸洗3次后加入稀释好的荧光二抗，20～37 ℃ 孵育1 h。孵育完成后使用PBST浸洗三次后，加入DAPI再孵育5 min，洗去DAPI后加入封片液，在荧光显微镜下采集图像。

1.4 山羊精原干细胞的收集

在饲养层上培养14 d 后，利用0.05 % 胰酶消化精原干细胞克隆团，收集细胞差速贴壁2 h进行二次富集。富集后吹打数次后使未贴壁细胞悬浮，收集剩余未贴壁的精原干细胞。

1.5 细胞生长曲线的检测

收集的SSCs以每孔1×104个细胞接于24孔板内培养，SSCS基础培养基中分别添加20 ng/mL Epiregulin、20 ng/mL SCF、20 ng/mL 和100 ng/mL 的Epigen进行培养，同时预留空白对照组。每48 h使用细胞计数器对每组细胞计数，重复3孔。

1.6 CCK-8法对干细胞增殖活性的检测

收集的SSCs接入96孔板，每孔接种约2.5×103个细胞，基础培养基中分别添加20 ng/mL Epiregulin、20 ng/mL Epigen、 100 ng/mL Epigen和20 ng/mL SCF。每组5个重复，37 ℃、5 % CO2浓度培养箱中培养，并预留空白孔。每隔72 h 使用 90 μL DMEM以及10 μL CCK-8染色液进行孵育染色。使用酶标仪测定450 nm波长下各组平均OD值。

1.7 数据分析

所有试验组均设计3次重复。细胞数量和细胞活性的结果表示为“均数±标准差(Mean±SD)”，数据采用Statistical Product and Service Solutions (SPSS)19.0进行单因素方差分析检验显著性差异，其中P<0.05表示有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 山羊精原干细胞提取与鉴定

通过两次差速贴壁富集获取的曲细精管细胞，去除了部分杂细胞，细胞形态混杂度得到降低。差异贴壁后细胞免疫荧光检测鉴定结果显示(图1)，富集后的曲细精管细胞经过 7 d 培养后，具有较多的CD9和GFRA1阳性细胞，表明通过两次差速贴壁获得了纯度较高的山羊SSCs。

2.2 精原干细胞的培养以及收集

培养3 w的山羊SSCs形成了较多的SSCs小克隆团(图2)，山羊SSCs贴壁性弱于饲养层，通过低浓度胰酶的消化和差速贴壁能够富集培养的SSCs。SSCs培养体系能够长期体外培养SSCs，得到SSCs克隆团，能够为下一步试验提供较为丰富的SSCs。

图2SSCs经过1w(图A)、2w(图B)
和3w(图C)培养的克隆团形态(Bar=100μm)
箭头指向为山羊SSCs克隆团
Fig. 2 The goat SSCs after 1, 2 and 3 (A, B, C) weeks of
culture(Bar=100 μm)Arrows pointing to the goat SSCs clone

2.3 Epiregulin、Epigen和SCF对山羊精原干细胞生长曲线的影响

SSCs生长曲线见图3，添加100 ng/mL Epigen的处理组，其细胞数量4 d 开始高于其他处理组及对照组(P>0.05)。添加 100 ng/mL Epigen和20 ng/mL Epiregulin的处理组细胞数自第6 d 开始显著高于其他组(P<0.05)。至第12 d 添加100 ng/mL Epigen、20 ng/mL Epiregulin以及 20 ng/mL SCF的处理组细胞数显著高于其余两组(P<0.05)。

2.4 Epiregulin、Epigen和SCF对山羊精原干细胞细胞活力的影响

细胞活力见图4，相比于对照组，添加100 ng/mL Epigen、20 ng/mL Epiregulin的处理组第6 d 时显著高于其余两组(P>0.05)，而在第9 d 和第12 d 时20 ng/mL Epiregulin处理组其细胞活力均显著高于其他组(P<0.05)，而100 ng/mL Epigen组除显著低于Epiregulin处理组外，显著高于其余组(P<0.05)。

图3添加Epigen,Epiregulin和SCF的SSCs生长曲线
Fig. 3 The proliferation curve of SSCs cultured with Epigen, Epiregulin and SCF

3 讨 论

在体外培养条件下，多种细胞因子能够调节SSCs增殖，而表皮生长因子家族(EGF family)是其中重要的一类调控因子。Oatley等[14]发现，EGF能够与GDNF共同作用从而调节SSCs的增殖，阻遏其分化，从而提高其体外培养过程中的数量。而目前仍有较多EGFR配体对于SSCs的影响尚待研究，因此研究表皮生长因子家族成员对SSCs体外培养条件下的影响，能够对SSCs体外培养体系的优化提供理论参考。

Epiregulin作为EGF家族成员可以通过异源二聚化，激活PIK3-AKT和MEK-MAPK通路，调节血管生成、卵母细胞成熟和血管重塑，具有刺激DNA合成的生物活性，能够通过促进细胞增殖促进炎症、伤口愈合[3]。同时Epiregulin高表达于多种癌细胞中，癌细胞去甲基化能够导致其mRNA表达增加[15]。Wilson等[4]发现，Epiregulin相比EGF在多种细胞中对促进细胞增殖和DNA合成的效果更为显著。本研究结果显示，添加20 ng/ml Epiregulin能够显著提高山羊SSCs的细胞数量(P<0.05)，并且体外培养9 d后的细胞活力显著高于其他组(P<0.05)。相比同为EGF家族的Epigen，Epiregulin促进细胞增殖的效果更为显著，这与Wilson等[4]的结果相符合。Epiregulin作为一种特征性广泛的特异性EGF样配体，其对SSCs增殖更好的促进效果可能是因为其不仅能够激活ErbB-1和ErbB-4的同型二聚体，还能够激活所有可能的异二聚体ErbB复合物所致[4-5]。因此相较于EGF，其可以通过激活刺激ErbB-2/ErbB-3异二聚体从而促进细胞增殖和DNA合成。同时Shelly等[5]研究发现Epiregulin对MAPK的总活性提高较低，但比EGF的持续效果更长，而EGFR配体会差异性的影响EGFR降解，这表明Epiregulin可能是通过加速受体的退化和受体回收抑制等机制促进细胞增殖[4-6]。

在本试验中添加100 ng/mL Epigen 能够显著增加培养中SSCs的数量(P<0.05)，而20 ng/mL Epigen对于促进SSCs增殖的效果并不显著(P>0.05)。先前的研究表明小鼠SSCs培养基中EGF的添加量宜为20 ng/mL[14]，显著低于本实验中Epigen的有效浓度。Epigen能够刺激c-erbB-1和MAP的磷酸化从而促进细胞增殖[8]，Shiraishi[16]的研究表明，Epigen对EGF受体及ErbB1的亲和度低于EGF，促进人永生化表皮细胞增殖的添加量较TGFα高10倍，本试验结果趋势与之相符。Epigen的研究相对较少，目前认为造成这种差异的原因主要可能是因为不同EGFR对不同配体的特异性，以及不同配体影响EGFR内化，再循环和降解途径不同所导致[4,14]。

受体酪氨酸激酶c-Kit能够调控造血，黑素生成和配子发生[17]。对于睾丸组织，c-Kit能够调节雄性生殖细胞之前的原始生殖细胞迁移与分化，而SCF其能够与c-Kit结合从而激活下游信号通路对生殖细胞的生理活动进行调节[12]。Feng等[18]的研究表明添加SCF能够促进SSCs的增殖和分化。尹明[19]发现在含血清的培养条件下添加40 ng/mL SCF能够促进小鼠SSCs的增殖，同时SCF能够和bFGF形成协同作用促进小鼠SSCs的增殖。但是Kubota等[20]的研究表明，在无血清条件下单独添加SCF只能够略微提高小鼠SSCs在体外培养过程中的数量，同时并未检测到c-kit受体的表达上升。本试验结果中SSCs基础培养基内添加20 ng/mL SCF能够提高SSCs的增殖活性与细胞活力，这可能归功于SCF能够与GDNF、bFGF或血清中组分协同促进SSCs的增殖[18]，这与Feng等[26]以及尹明等[27]的研究结果相吻合。但是SCF的促增殖效果低于添加100 ng/mL Epiregulin和100 ng/mL Epigen，这可能因为SCF在促进SSCs增殖的同时，能够诱导SSCs的分化为次级精母细胞，从而影响到了SSCs的增殖[19]。虽然Epiregulin、Epigen和SCF均能够促进山羊SSCs的增殖，但其对于SSCs调控的具体机理尚待进一步研究。

4 结 论

本研究结果表明，精原干细胞基础培养基中添加100 ng/mL Epigen、20 ng/mL的Epiregulin和20 ng/mL的SCF能够显著提高山羊精原干细胞的增殖和细胞活力，但是添加SCF效果显著低于Epigen和Epiregulin组。