家畜肠道微生物代谢组学研究进展

叶 勇，全建平，吴 杰，周身娉，郑恩琴，吴珍芳，杨 杰，徐 铮

(华南农业大学 动物科学学院/国家生猪种业工程技术研究中心，广东 广州 510642)

肠道微生物在家畜生长发育、营养代谢和健康免疫等方面都有重要的作用。肠道微生物与宿主在漫长的协同进化过程中，相互选择并形成了互惠共生的关系。一方面宿主选择性的定植某些微生物群落，并为其提供稳定且营养丰富的生存环境；另一方面，这些微生物及其代谢产物既能影响宿主神经免疫系统的发育，维持肠道功能和胃肠道屏障完整性，还能参与宿主营养代谢调控及影响宿主繁殖性状等[1]。肠道微生物群落之间、微生物与宿主之间持续不断的相互作用，形成了肠道内动态平衡的复杂微生物生态环境[2]。了解家畜肠道微生物的组成和分布信息以及对微生物群落的功能进行预测和代谢物检测分析，以采取有效手段调控肠道微生物，可提高生产效率。利用代谢组学方法检测家畜动物粪便或肠道内容物中微生物群落的代谢产物，可进一步研究微生物和宿主的代谢产物种类和含量的变化规律，以揭示微生物与宿主体内的代谢互作[3]。

1 肠道微生物代谢物

微生物群落活动会吸收或产生许多代谢物，如脂肪酸、激素和维他命等，这些代谢物是基因和蛋白质表达的下游产物(表1)。已有研究证明对这些代谢物进行定量分析能够反映微生物群落代谢性能变化[4]。复杂碳水化合物在结肠中经微生物发酵成短链脂肪酸(SCFAs)，主要为乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐，是微生物代谢最重要的产物之一。其中，丁酸盐除了作为结肠上皮细胞的营养源之外，在免疫调节中也发挥重要作用。丁酸盐抑制巨噬细胞的核因子(Nuclear Factor Kappa β, NF-κB)的活化，并抑制急性髓样细胞白血病组蛋白去乙酰化(Histone Deacetylation, HDAc)[5-6]。NF-κB是一种真核转录因子，参与并控制免疫和炎症反应。HDAc抑制在特定的炎症信号传导途径以及表观遗传机制中起作用。有小鼠研究强调了丙酸盐和丁酸盐在调节性T细胞生长和抑制HDAc的潜在作用[7]。而丙酸和乙酸经血液流到不同器官中，被用作氧化、脂质合成以及能量代谢的底物，特别是在肝脏中，肝细胞使用丙酸进行糖异生[8]。胆碱作为一种必须的膳食营养素，主要在肝脏中代谢。肠道微生物酶能催化胆碱转化为三甲胺，然后在肝脏中进一步氧化产生三甲胺N-氧化物。三甲胺N-氧化物是肝脏和心血管疾病相关的标志代谢物[9]。初级胆汁酸在肝脏中合成，其主要功能是促进脂肪和脂溶性维生素的吸收和胆固醇的分泌。约5%～10%的胆汁酸经肠肝循环后在肠道中经微生物转化为次级胆汁酸[10]。次级胆汁酸能控制特定的宿主代谢途径，并通过G蛋白偶联受体，如胆汁酸受体(TGR5)和法尼酯X激活受体(Farnesoid X Receptor, FXR)，参与肠道免疫调节和代谢调节，影响微生物群落的组成结构[11]。研究证明，吲哚有助于改善上皮细胞功能，调控细胞因子的表达，以抑制炎症反应[12]。吲哚必须由几种特定微生物(例如大肠杆菌，卵形拟杆菌，梭状芽孢杆菌等)降解色氨酸生成，宿主不能自身合成。

表1 部分家畜肠道微生物代谢物[13]Table 1 Livestock intestinal microbial metabolites

2 代谢组学检测

2.1 方法策略

目前最为常用的代谢组学研究策略有靶向代谢组学和非靶向代谢组学两种。靶向代谢组学实验可以验证已筛选的代谢差异物，并能提供定量的代谢物浓度，具有高特异性、精确性和准确性等特点。非靶向代谢组学实验旨在描述样品中全部的代谢物，对代谢物进行半定量的检测，通过尽可能多的检测代谢物来比较不同样品，以筛选生物标记物[14]。此外，广泛靶向代谢组是介于两者之间的代谢组学研究策略[15]。这种方法结合两种研究策略的特点，提供代谢物定量和半定量浓度，比非靶向代谢组学具有更高的准确性和特异性，同时能检测到比靶向代谢组学更多的代谢物[16]。

2.2 样品保存和预处理

在用粪便或肠道内容作物为样品检测代谢物时，消化肠道内不仅有数万亿的细菌微生物和宿主上皮细胞，还有不断摄入的营养分子和微生物群落释放的小分子化合物。微生物及其代谢物、宿主细胞及其代谢物、外源营养分子等构成了肠道内容物和粪便样品中复杂的生物学环境。因此样品预处理会对代谢组学的检测结果产生巨大影响。

直接提取分析肠道内容物或粪便样品中全部的代谢物分子是动物实验中常用的方法[17]。通过这种方法检测到的代谢物是宿主和微生物群落共同代谢的结果。而先从样品中富集提取出微生物细胞，分析微生物细胞中的代谢物沉淀是研究环境因子、宿主和微生物之间相互联系的更有效的方法[18]，该方法主要利用差速梯度离心的方式，首先富集样品中的肠道微生物细胞，然后分别用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)级的甲醛和水萃取微生物细胞沉淀，制取用于提取检测代谢物的混合溶液，以此进行代谢组检测。肠道微生物活动中直接生成或吸收的代谢物更能代表微生物的活动和变化，并且这种方法可以提供与宏基因组数据直接相关的信息，与使用全部内容物或粪便样品检测代谢物相比更为真实可信。

2.3 分析平台

代谢组学分析需要根据不同的实验目的和样品特性以及代谢物的理化特性选择合适的分析平台[19]。最常用的分析技术主要是质谱(Mass Spectrometry，MS)技术和核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)。

色谱质谱联用平台的特点是结合了色谱良好的分离能力和质谱的普适性、高灵敏度以及专一性。气相色谱质谱(Gas Chromatography-mass Spectrometry, GC-MS)更适合用于挥发性热稳定化合物；而毛细管电泳质谱(Capillary Electrophorsis-mass Spectrometry, CE-MS)适用于小型可电离分子；液相色谱质谱(Liquid Chromatography-mass Spectrometry, LC-MS)平台分析的代谢物分子量明显高于GC-MS，而且超高效液相色谱与质谱联用(UPLC-MS)具备更高的分析能力。具体而言，LC-MS主要用于检测不同类型的胆汁酸和脂质，CE-MS主要用于氨基酸、胺和羧酸，GC-MS主要用于短链脂肪酸和氨基酸[19]。在任何色谱-质谱系统中，样品不可避免的直接与仪器相互作用，导致在测定过程中分析物响应随时间的变化而变化。NMR的灵敏度较色谱-质谱系统偏低，但是样品和仪器操作部分没有物理相互作用，没有仪器污染的灵敏度变化，因此具有较好的重复性[19]。

2.4 数据处理和检验

用色谱-质谱联用平台或核磁共振的方法，在模式识别分析之前都需要对获取的原数据进行前处理，将高维的复杂数据进行降维和简化。为了充分挖掘所获得数据中的潜在信息，对数据的后期分析需要应用一系列的计量学和多元统计分析方法，即模式识别，随后比对数据库以鉴别差异代谢物。如果没有找到差异代谢物，那么还可以就检测到的物质进行通路分析，观察是否有其他的补给途径、代谢途径与性状之间存在一定的关联性等。找出差异代谢物之后可使用ROC分析进行模型验证。

3 肠道微生物代谢物对宿主的影响

3.1 微生物代谢物对宿主营养代谢的影响

3.1.1 微生物代谢物与蛋白质代谢 家畜摄入的膳食蛋白质和内源性蛋白质在小肠腔中混合和消化，在大肠中被微生物发酵。在肠道中，蛋白质代谢产生的能量可以作为肠上皮细胞的部分能量来源[20]。蛋白质先被蛋白酶水解成氨基酸和肽，通过转运蛋白进入细菌细胞。氨基酸可以在微生物细胞中作为合成蛋白质的原料直接利用，也可以进入分解代谢途径，主要的代谢反应是在结肠中发生Stickland反应，产生相应的酮酸[20]。其中，丙酮酸是一个重要的发酵代谢反应起点，经过一系列反应，末端H-受体生成短链脂肪酸(主要是乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐)、有机酸(主要是甲酸盐，乳酸和琥珀酸盐)、H2和CO2[21]。通常有机酸不会累积，而是被其他细菌物种迅速进一步代谢成短链脂肪酸。另外，肠道微生物可以从头合成一些蛋白质生物合成所需的氨基酸，有助于调节体内氨基酸稳态。微生物代谢所产生的氨基酸还能够作为信号分子，激活mTOR通路，促进宿主细胞蛋白质的沉淀，从而改善肠道内的营养水平[22]。

氨是家畜粪便中刺激性气味的主要来源，肠道中大部分的氨气被排除体外，释放到空气中，对人与动物健康都有着不良影响。肠道菌群发酵氨基酸，经过脱氨基作用以及分泌脲酶以分解尿素生成氨气[23]。生成氨气所涉及到的微生物种类较多，尚未确定影响氨气生成的主要菌种是哪一类。硫化氢也是家畜排放臭气中的主要物质之一，其含量仅次于氨。B.wadsworthia菌的牛磺酸和羟乙磺酸代谢涉及含硫氨基酸的脱硫反应，生成游离的亚硫酸盐，然后在异化亚硫酸盐还原酶的作用下生成硫化氢[24]。此外，部分异养菌对半胱氨酸的脱硫作用也有助与硫化氢的生成[25]。

还有许多复合氨基酸经历一系列反应代谢，包括裂变、脱氨基、脱羧氧化和还原等，产生各种相对应的代谢终产物。例如，酪氨酸产生4-乙基苯酚、苯酚和对甲酚，色氨酸产生吲哚和粪臭素[26]。

3.1.2 微生物代谢物与碳水化合物代谢 肠道微生物发酵碳水化合物产生短链脂肪酸(Short-chain Fatty Acids, SCFAs)，主要包括甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐等。已经证明SCFAs，特别是丁酸盐是维持结肠上皮细胞结构的重要底物，是结肠上皮细胞的重要能量来源[27]。丁酸盐通过上调紧密连接蛋白Claudin-1的转录来增强肠上皮屏障功能[28]。SCFAs在食欲调节和能量摄入方面起着重要作用。试验证明，丙酸盐通过激活受体FFAR2(Free Fatty Acid Receptor 2)和FFAR3(Free Fatty Acid Receptor 3)来增加胃肠激素 (Peptide YY, PYY)和胰高血糖素样肽-1 (Glucagon-like Peptide-1, GLP-1)的含量，从而调节短期食欲和影响血浆葡萄糖水平[29]。PYY被称为饱腹激素，能够增加肌肉和脂肪组织中葡萄糖诱导分泌的胰岛素水平，GLP-1通过增加胰岛素的分泌和减少胰腺分泌胰高血糖素间接调节血糖水平。丙酸盐还可以通过血液循环运输至肝脏部位，可作为糖异生与脂质合成的反应底物，被肝脏细胞重新利用[8]。乙酸进入外周组织中，作为胆固醇等生理活性物质的合成原料[30]。关于甲酸盐在肠道中的作用研究相对较少。甲酸盐与产生甲烷有关，并且在炎症条件下浓度可能会提高[31]。乳酸可以进一步代谢生成乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐[32]。

3.1.3 微生物代谢物与脂质代谢 SCFAs除了能参与碳水化合物代谢之外，还可以参与调节脂肪酸合成、氧化和体内脂肪分解之间的平衡。SCFAs已被证明可以激活肝脏和肌肉组织中AMP蛋白激酶的活性,以触发PGC-1α基因的表达，从而增加产热和脂肪酸氧化[33-34]。肝脏中的脂肪分解似乎受SCFAs的影响不大，但是研究发现，乙酸盐和丙酸盐能够抑制脂肪组织中的脂肪分解，促进脂肪生成[35]。其机制为，FFAR2介导的脂解抑制首先激活G蛋白，G蛋白抑制腺苷酸环化酶活性，从而减少ATP中cAMP的生成，降低蛋白激酶A的活性，导致脂肪组织中激素敏感脂肪酶(Hormone-sensitive Triglyceride Lipase, HSL)的去磷酸化和失活。HSL可以水解甘油三酯，是控制脂肪组织脂解的关键分子之一，失活后可达到抑制脂肪分解的效果[36]。另外，FFAR2在白色脂肪组织的脂肪储存中也起着重要作用。研究表明FFAR2缺失的小鼠在正常饮食中是肥胖的，而在脂肪组织中特异性过表达FFAR2的小鼠即使在喂食高脂肪饮食时也能保持身材[37]。瘦素是一种重要的脂肪来源稳态信号，可以调节能量平衡和食欲。乙酸盐似乎也刺激脂肪细胞中的瘦素的分泌[38]。

3.2 微生物代谢物对动物繁殖性能的影响

对孕期母畜和种公畜的肠道微生物的调节，尤其是氨基酸相关的微生物调节，对家畜的繁殖性能以及子代的健康十分重要。研究表明，肠道微生物代谢生成氨基酸等代谢产物的同时，还会产生含硫、含氮的代谢物。过量的含硫、氮代谢物(硫化氢、一氧化氮等)会进入循环系统，影响宿主健康。家畜动物繁殖阶段，微生物代谢产物可通过精子、卵子、生殖道、母乳等多个繁殖环节影响新生幼畜的健康[39]。因此，调节孕期亲代的肠道中与氨基酸代谢相关的微生物是调节和维持机体代谢平衡和生殖健康的关键[40-41]。研究表明，母体怀孕期间肠道内会发生各种变化，包括增加肠道运动，增强营养吸收和肠道通透性，以及改变肠道微生物群落组成结构等。先前对环江小型猪的研究表明，根据怀孕第一至第三孕期不同营养水平的饮食，细菌代谢产物会发生变化[42]。怀孕和哺乳期间的母体营养水平可能通过改变后代早期肠道微生物的丰度而对后代产生重大影响[43]。后代早期的肠道微生物群落组成与其长期的健康有关，妊娠早期和母乳喂养期间的母体饮食会影响母亲和后代的微生物群落组成，对母亲和后代具有长期影响[44]。

雄性动物繁殖性能也与氨基酸的利用和代谢有关。循环中足量的氨基酸，特别是精氨酸，对于精子的生成、分化和成熟都至关重要，从而影响精子的数量和质量[40]。在小肠腔中，微生物(特别是表达高水平精氨酸酶的微生物)数量的增加将促进膳食精氨酸的分解代谢，因此有助于精子活力。5-羟色胺是一种色氨酸相关的代谢产物，对于中枢神经和外周神经对射精的控制很重要[45]。据报道，血清素可以通过激活脑或脊髓中不同的5-羟色胺受体来增加或减少射精潜伏期，其净效应是延长射精和延迟性高潮[46]。最近对小鼠的研究表明，由酪丁酸梭菌产生的丁酸盐等代谢物通过血液屏障的渗透性和睾丸的内分泌功能来改善睾丸的发育[47]。

3.3 微生物-脑-肠轴

3.3.1 大脑向肠道微生物的信号传导 中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)与胃肠道功能通过微生物-脑-肠轴进行双向调节。目前这种微生物与宿主的互作机制研究主要集中在人类和小鼠中。在一项改变小鼠饮食的研究中，食用抗性淀粉的小鼠肠道菌群发生改变，同时伴随着体重增加不足和焦虑等现象[48]。这些研究对家畜动物的经济生产、动物健康等方面同样具有很大的指导意义。

CNS对肠道微生物的调节可以分为直接调节和间接调节两种。直接调节是指CNS可通过神经内分泌通路直接影响肠道微生物群落，分泌的神经递质通常涉及儿茶酚胺，其浓度可受到宿主身体和心理压力的影响。间接调节则是通过调节肠道环境间接影响肠道微生物群落。间接信号传导涉及自主神经系统(Autonomic Nervous System, ANS)，其交感神经和副交感神经两条分支都可以调节肠道生理生化变化，从而影响微生物的组成和功能[49-50]。ANS还可以通过调节杯状细胞功能以及肠上皮细胞通透性来调节肠黏膜层的完整性[51]。

3.2.2 微生物群落向大脑的信号传导 微生物代谢产物是从肠道微生物到中枢神经系统的通信介质，主要包括短链脂肪酸，二级胆汁酸和色氨酸代谢物等[52]。有一些直接与肠内分泌细胞、肠嗜铬细胞和粘膜免疫系统相互作用，向中枢神经系统传递信号。另一些代谢物能够穿过肠壁屏障进入体循环，甚至可以穿过血脑屏障，对宿主发生信号[53-54]。

越来越多的研究表明，微生物群落在宿主神经免疫信号传导中起着重要作用。微生物群落对神经系统的作用主要表现为影响神经胶质细胞的发育。小胶质细胞参与早期CNS的发育，并且在整个生命过程中具有维持稳态、抗原呈递、吞噬作用和调节炎症的作用[55]。Erny等[51]发现无菌小鼠和抗生素治疗的小鼠相较于正常小鼠显示出未成熟小胶质细胞的比例增加，表明微生物代谢产生的SCFAs在促进小胶质细胞成熟和维持正常功能方面具有不可或缺的作用。研究结果还表明，宿主细菌可以对小胶质细胞的成熟和功能进行过度调节，而小胶质细胞损伤可以通过复杂的微生物群在一定程度上得到纠正[51]。尽管SCFAs的重要作用肯定与小胶质细胞发育和功能的调节有关，但驱动这些变化的确切机制以及潜在的其他微生物介质作用尚未完全解释清楚[55]。研究肠道微生物对小胶质细胞不同发育时段的影响也很重要。Matcovitch-Natan等[57]的研究结果显示，与对照组正常小鼠相比，成年无菌小鼠小胶质细胞基因表达谱下调程度高于新生无菌小鼠，这将微生物组与小胶质细胞从前期表型到成体表型的转变联系起来。

微生物和CNS之间的相互作用还涉及星形胶质细胞。星形胶质细胞代表功能多样的神经胶质细胞群，其作用包括离子稳态的维持、神经递质清除、糖原储存、血脑屏障的维持和神经元信号传导的支持、以及它们在神经炎症中的突出作用[57]。微生物代谢产物可通过调节星形胶质细胞中的I型干扰素信号传导来激活芳基烃受体(Arylhydrocarbon Receptors, AhRs)以减轻炎症，其中，吲哚是最重要的微生物代谢的AhR激动剂之一[59-60]。肠腔中大多数未消化的膳食色氨酸被专门的微生物色氨酸酶转化为吲哚，然后在微生物和肝脏中进一步代谢或修饰，产生对AhR具有不同亲和力的吲哚衍生物[61]。

3.3.3 自下而上的信号屏障 脑肠轴内自下而上的信号通过两个动态屏障调节：首先是肠道上皮屏障，由与上层细胞间紧密连接蛋白相连的基底单层上皮细胞和含有抗菌肽和分泌型免疫球蛋白的动态粘液层组成[62]；其次是血脑屏障，由与紧密连接蛋白相连的脑内皮细胞组成，是血管与中枢神经系统之间的重要屏障[63]。与肠道上皮屏障相比，血脑屏障具有更高的选择性。

肠道上皮屏障在维持肠道稳态中起着重要作用，能够促进营养物质、水和电解质的吸收。胃肠粘膜中的模式识别受体，如Toll样受体(Toll-like Receptors, TLR)等，被特定的微生物代谢产物激活，以增强宿主胃肠道内的抵抗病原微生物、肠道抗炎的能力和免疫耐受性[64-65]。粘液层居住着大量肠道微生物，形成了一种动态屏障，也是一种富含糖蛋白的生物膜[66]。这种保护性生物膜在低膳食纤维期间可被微生物降解，从而增加病原体易感性[67]。丁酸盐作为上皮细胞重要的能量来源，可以增加上皮细胞增殖分化，促进紧密连接蛋白的组装和表达以增加粘液分泌促进肠道上皮屏障的完整性[68]。肠道屏障的通透性也可能受到炎症介质和交感神经系统活动的影响[69-70]。

血脑屏障(Blood-brain Barrier, BBB)代表循环系统和CNS的脑脊髓之间的扩散屏障。肠道微生物群可通过调节紧密连接蛋白的表达来影响该屏障的通透性[63]。临床证据表明，SCFAs可作为关键信号代谢物，通过表观遗传修饰调节受微生物影响的BBB发育和维持。研究表明，丁酸盐驱动的表观遗传变化可能在调节紧密连接蛋白表达中发挥重要作用[63]。另外，由于乙酸是一种低分子量的SCFAs，可以穿过BBB为大脑用作能量来源，因此可能调节BBB通透性[71]。脂多糖也可能具有游离性，可能在一定程度上通过全身免疫激活来破坏BBB[72]。

4 展 望

肠道微生物及其代谢产物调控家畜动物的生长发育和免疫健康。研究家畜动物肠道内微生物的组成和结构，分析其代谢产物和筛选标志代谢物，揭示微生物与宿主之间的相互作用，为重要畜牧经济动物的遗传育种，性状改良和疾病诊断等提供重要理论基础。逐渐有新的代谢组学研究分析技术，如代谢流分析和单细胞代谢组学等，提供了更加全面精确的测量与分析。然而，作为基因组学和蛋白质组学之后发展起来的新的组学技术，代谢组学数据库还不完整，制约了代谢组学与其他组学之间的关联分析。随着组学技术的发展和研究的不断深入，肠道微生物及其代谢产物与宿主的互作机制也将逐渐明朗，对于挖掘和改良农业动物优质性状至关重要。