绒山羊MARCH1基因InDel位点与体尺性状的关联研究

赵 森，王 真，白洋洋，郭 凯,李增辉，长孙伟光，屈 雷，蓝贤勇，宋晓越*

(1.榆林学院 生命科学学院，陕西 榆林 719000；2.榆林学院 陕西省陕北绒山羊工程技术研究中心，陕西 榆林 719000；3.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌712100)

内蒙古白绒山羊作为优良的地方绒肉兼用型品种，是经过长期自然选育形成的，其羊肉中粗脂肪和粗蛋白含量较高，价格较其他羊肉高，因此具有较高的选择育种价值[1-2]；而体尺性状作为重要的经济性状，开展体尺性状表型的选育对于提高内蒙古白绒山羊的经济价值有重要意义。利用传统方法对家畜体尺性状进行改良选育难度较大，而快速、有效的分子标记辅助选择(marker assisted selection, MAS)技术常能取得较为理想的结果。作为一种高效简单的MAS方法，相比较单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)和拷贝数变异(copy number variations, CNV)，插入缺失标记(Insertion/Deletion, InDel)可直接对基因多态进行检测[3]，同时具有高准确性、高稳定性和结果清晰易判断等优点[4]。故借助InDel方法对家畜体尺性状相关候选基因进行筛选已被广泛应用且具有较好的应用前景[5-6]。

利用InDel方法对内蒙古白绒山羊进行育种选择时，首先要找到具有研究价值的潜在生长候选基因。目前山羊上已发现存在一些重要的关键候选基因与体尺性状显著相关，包括MSTN、GHR、IGF2、POU1F1基因等[7-9]。仍有潜在的山羊生长候选基因有待发掘。有文献报道，膜相关RING-CH型蛋白1(membrane-associated Ring-CH Protein 1, MARCH1)是膜结合的E3泛素连接酶MARCH家族的成员, 该家族的成员分布广泛，参与多种细胞功能[10]，而MARCH1基因，又称RNF171，在山羊上全长501 087 bp，包含6个外显子和5个内含子，含约289个氨基酸，在免疫系统中具有重要的调节作用，并参与多种信号通路，包括PI3K-AKT，NF-κB和Wnt/β-catenin信号通路[11-12]。最近的研究发现，肥胖人群白色脂肪组织中MARCH1表达显著增加，雌性敲除小鼠在标准饲料喂养条件下会出现体重过度增加，脂肪增多现象[13-15]，故我们推测MARCH1基因可影响山羊的体尺性状并可作为山羊的生长相关候选基因。有文献报道，在陕北白绒山羊品种中，MARCH1基因启动子区存在7-bp(NC_030813:g.1858696insTAATACG)突变位点，该位点能显著影响山羊头胎产仔数[16]，但目前还未见此位点在内蒙古白绒山羊群体中的报道及与体尺性状关联分析的研究。本研究通过检测MARCH1基因的InDel，探究了MARCH1基因启动子区7-bp indel突变位点在内蒙古白绒山羊中的多态性分布及与体尺性状的关系，旨在为我国绒山羊体尺性状的遗传改良提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

从内蒙古自治区和陕西省交界处随机选取460只健康的无血缘关系的内蒙古白绒山羊母羊，其中包括318只18月龄左右的育成羊和142只36月龄左右的成年羊，记录山羊耳号。同生长阶段试验羊的饲喂日粮及生长环境相同。

1.2 样品的采集及体尺指标的测定

用剪耳钳剪取试验羊黄豆大小的耳组织，放入加有1 mL体积分数70%乙醇的离心管中，在冰盒中保存带回，保存于-80 ℃冰箱。采样同时，测量山羊的体重、体高、体长、胸围、髋宽、管围、荐高、胸深和胸宽等体尺数据[17]。

1.3 引物设计与合成

MARCH1基因启动子区7-bp突变位点(NC_030813:g.1858696insTAATACG)上游引物为5′-ACTGTGCATCAAGAATGTGGAAA-3′，下游引物为5′-TGAGGTACATGGAAATGGCAAA-3′。InDel位点信息及引物序列来自文献[16]，引物由西安擎科泽西生物科技有限责任公司合成。

1.4 MARCH1基因的PCR扩增与分析

利用内蒙古白绒山羊耳组织提取全基因组DNA[18]。MARCH1基因的PCR扩增体系为：PCR Master Mix 12.5 μL，模板DNA(20 ng/μL)1.2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，用超纯水补至25 μL。PCR扩增条件： 94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，49.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸12 s，34个循环；72 ℃延伸5 min。检测PCR扩增产物分型采用3.5%的琼脂糖凝胶电泳。

1.5 数据统计与分析

利用在线网站SHEsis(http://analysis.bio-x.cn)分析了MARCH1基因启动子区7-bp多态位点在群体对象中的哈代-温伯格平衡常数和基因型频率等结果。应用一般线性模型分析不同参数对性状的影响：Yijk=μ+Gi+Eij，这里μ为总体平均值，Gi代表基因型固定效应，Eij代表随机误差。利用SPSS软件，分别运用单因素方差和独立样本t检验方法对此InDel位点与体尺性状进行关联分析，结果用“平均值±标准误(means±SE)”表示。利用SPSS软件中Pearson分析内蒙古白绒山羊的体重和体尺性状的皮尔逊相关系数[19-20]。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增与测序结果

根据合成的引物对MARCH1基因启动子区7-bp(NC_030813:g.1858696insTAATACG)突变位点进行PCR扩增，结果显示MARCH1基因突变位点存在3种基因型：纯合插入型(II)、杂合型(ID)和纯合缺失型(DD)，其中II基因型目的片段为192-bp，ID基因型为185-bp和192-bp，DD基因型为185-bp(图1)，测序图与电泳图结果一致(图1)。

2.2 MARCH1基因突变位点的遗传参数多样性分析

MARCH1基因启动子7-bp突变位点的基因频率和基因型频率分布如表1所示。结果显示：在318只育成羊和142只成年羊群体中，MARCH1基因启动子区7-bp突变位点II基因型均为优势基因型，属于低度多态(PIC<0.25)，且均符合哈代-温伯格平衡(P>0.05)；将育成羊和成年羊合并分析后发现，在随机挑选的460只内蒙古白绒山羊群体中，此突变位点同样符合上述结论：该位点II基因型均为优势基因型，属于低度多态(PIC<0.25)，符合哈代-温伯格平衡(P>0.05)[21]。

表1 内蒙古白绒山羊群体MARCH1基因多态位点遗传参数值Table 1 Genetic parameters values of MARCH1 gene polymorphism locus in Inner Mongolia cashmere goats

2.3 MARCH1基因多态性与体尺性状相关分析

将MARCH1基因启动子7-bp位点多态与内蒙古白绒山羊育成羊和成年羊的体尺性状进行关联分析(表2)。结果显示，在内蒙古白绒山羊育成羊群体中，在体高性状上，MARCH1基因启动子区7-bp位点DD基因型显著优于ID和II基因型(P=0.01)；在体长性状上，ID基因型显著优于II基因型(P=0.036)，其他性状不同基因型之间差异不显著(P>0.05)。在成年羊群体中，因为只有一个样本为DD基因型，故没有对其进行关联分析，在管围性状上，MARCH1基因启动子区7-bp位点ID基因型显著优于II基因型(P=0.040)；其他性状不同基因型之间不显著(P>0.05)。

表2 内蒙古白绒山羊MARCH1基因多态与体尺性状的关联分析Table 2 Correlation analysis of growth traits of Inner Mongolia cashmere goats with polymorphisms in the MARCH1 gene

注：数据显示为平均值±标准误； a，b代表P值小于0.05。

Note: Data are shown as mean±standard error; a, b meansP<0.05.

2.4 内蒙古白绒山羊体高、体长和管围性状的皮尔逊相关性分析

将内蒙古白绒山羊的体重和体尺性状进行皮尔逊相关系数(pearson correlation coefficient, Pearson's r)分析(表3)。结果显示，内蒙古白绒山羊的体高与体重之间存在极显著的关联(P=9.37E-38)，Pearson's r =0.597；体长与体重之间存在极显著的关联(P=1.10E-106)，Pearson's r = 0.851；管围与体重之间存在极显著的关联(P=3.30E-11)，Pearson's r = 0.333。

3 讨 论

已有文献表明，敲除MARCH1基因能影响雌性小鼠在标准饲喂条件下的脂肪储存和胰岛素敏感性，提示MARCH1可能是脂质代谢和糖耐量的调节因子，进而可能影响机体的生长发育[15]。而基因启动子作为控制基因表达时间和程度的"开关"，能决定基因的表达活动。最近研究报道，存在启动子区域的功能性InDel可能通过影响转录活性最终影响山羊的繁殖性能[16,22]。本研究通过探究MARCH1基因启动子InDel多态与内蒙古白绒山羊体尺性状的关系，揭示MARCH1基因启动子多态与内蒙古白绒山羊体尺性状有显著影响，此InDel位点在等位基因D存在的情况下，群体表现出较好的体尺性状。提示MARCH1基因启动子7-bp突变位点能显著影响内蒙古白绒山羊的多种体尺性状且具有较大的选择空间，故今后可考虑对此位点DD基因型进行选择育种。

表3 内蒙古白绒山羊体尺性状的皮尔逊相关性分析Table 3 Pearson correlation analysis of growth-related traits in Inner Mongolia white cashmere goat

**. 在 0.01 级别(双尾)，相关性显著。

**. at level 0.01 (double-tailed), the correlation was significant.

先前对MARCH1基因功能的了解主要来自于其在T细胞抗原表达及作用的研究[10,23]。然而，最近研究表明，雌性MARCH1基因敲除小鼠相比较对照组，体重增加更多，内脏脂肪也更高，这说明MARCH1基因在参与机体生长发育过程同样具有重要作用[14-15]，本研究发现此位点DD基因型体重均值高于ID和II基因型，与其他体尺性状的结果一致，但不存在显著关联，猜想这可能是存在以下原因：(1)个体的体尺性状是由微效多基因控制的，不同生长阶段可能存在其他基因表达调控的影响，例如最近报道，IGF1、IGF2和MSTN基因对猪的生长性状有影响，可能具有协同调控作用[24]；GDF9基因作为生长候选基因，主要在绵羊成年期表达[25-26]，说明绵羊的生长时期也受其他生长基因的表达调控。(2)个体生长发育过程中常伴随基因的时序表达，例如重要的生长相关基因MSTN在小鼠不同发育阶段心肌组织中均有表达, 但其在小鼠老年时期的表达量最高, 体成熟时期的表达量最低[27-28];猪骨骼肌中PRKAG3基因存在生长阶段表达差异[29]，所以在内蒙古白绒山羊育成和成年期可能伴随MARCH1基因的差异表达。(3)因为样本量对实验结果有较大影响，后期可通过扩大样本量进行进一步分析。

本研究对育成期和成年期山羊管围性状进行关联分析，结果ID基因型个体相比较II基因型个体均具有较好的性状。虽然此位点在育成期山羊管围性状没有达到显著水平(P>0.05)，但仍具有相同趋势，并最终在已经发育完全的成年羊上达到显著水平(P=0.040)，说明此位点确实能影响山羊的管围性状。推测此位点对育成期山羊管围性状没有达到显著水平，可能是因为育成期山羊体型未发育完全[30]及MRACH1基因表达的延迟效应等。将内蒙古白绒山羊的体重和体尺性状进行皮尔逊相关分析表明，内蒙古白绒山羊的体高、体长和管围与体重之间存在极显著的相关(P<0.01)。Zhang[19]最近研究发现，重要经济性状之间通过显著相关会起到协同促进作用。表明MARCH1基因此启动子多态可能会间接影响内蒙古白绒山羊体重性状，但具体作用机制还需进一步验证。

本试验借助高效、准确的InDel分型技术，发现MARCH1基因启动子7-bp突变位点对内蒙古白绒山羊体尺性状具有显著作用，揭示MARCH1基因可作为内蒙古白绒山羊优良体尺性状遗传选育的候选基因，为我国山羊业的遗传选育工作提供一定的科学依据。

4 小 结

基于快速、有效的检测InDel变异的琼脂糖凝胶电泳和测序技术对内蒙古白绒山羊体尺性状进行分子标记辅助选择，发现MARCH1基因启动子区7-bp(NC_030813:g.1858696insTAATACG)突变位点多态能显著影响内蒙古白绒山羊的体高、体长和管围性状，可作为内蒙古白绒山羊分子标记辅助选择的有效DNA分子标记。