橘青霉侵染对杨梅果实酚类物质代谢作用的影响

郭 欣，郭 萌，陈 莲

橘青霉侵染对杨梅果实酚类物质代谢作用的影响

*郭 欣1,2，郭 萌1,2，陈 莲3

（1. 漳州职业技术学院食品工程学院，福建，漳州 363000；2. 农产品深加工及安全福建省高校应用技术工程中心，福建，漳州 363000；3. 闽南师范大学生物科学与技术学院，福建，漳州 363000）

以采前套袋控制病原菌潜伏侵染的杨梅果实为材料，采后接种橘青霉病菌，旨在研究橘青霉侵染对杨梅果实酚类物质含量及相关氧化酶活性变化的影响。结果表明：橘青霉侵染初期，杨梅果实细胞多酚氧化酶(PPO) 、过氧化物酶 (POD)活性呈上升趋势，酚类物质快速合成以提高自身的抗病能力。而同时期苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性并没有相应增加，反而下降较快，致使木质素合成受阻，说明橘青霉侵染虽然诱导杨梅果实产生一定的抗病性，但这种抗病能力有限。贮藏中后期，虽然POD活性略有下降，PPO活性保持平稳，但二者始终处于较高水平，从而导致前期积累的酚类物质被大量降解，加上前期木质素合成受阻的影响，橘青霉更容易穿透杨梅果实细胞壁，进入细胞组织内繁殖生长，最终导致果实腐败。

杨梅；橘青霉；酚类物质代谢；抗病性；防御酶

杨梅是我国的特色水果之一，因果实色泽艳丽、柔软多汁、酸甜适口而深受消费者喜爱。杨梅果实采收于5~6月高温多雨季节，其果肉组织细腻，细胞膜饱和度高，并且无果皮包裹，在贮存和运输过程中极易被碰伤，从而易受到病原菌的侵染。饶汉宗[1]等人研究发现，绿霉病是杨梅果实成熟期主要的真菌性病害，该病由橘青霉() 侵染引起，受害杨梅果实发软腐败。本课题组以前研究认为，杨梅果实采后腐烂与采前橘青霉潜伏侵染有关。目前，国内外针对杨梅果实病害的研究多集中于病原菌的分离鉴定和综合防控技术方面[2-3]，但对于采前病原菌潜伏侵染引起的杨梅果实腐败生理生化机制研究文献报道较少。

酚类物质是果实体内一类重要的次生代谢物质。许多学者研究证明，酚类物质代谢与植物抗病性密切相关。唐永萍等[4]研究了不同灰霉病抗性苹果果实中酚类物质代谢特征，发现抗性品种苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）活性都发生显著的先升后降的变化，且均高于感病品种。Wang等[5]通过热处理诱导杨梅果实中几丁质酶、β-1,3葡聚糖酶等酶活性的上升，提高果实的抗病性，有效降低杨梅采后绿霉病的发生。刘美艳等[6]研究表明，甘薯块根受黑斑病浸染后，PAL及PPO活性上升，同时绿原酸及总酚含量也显著增加，有利于提高甘薯抗黑斑病的能力。

本研究以杨梅果实为材料，研究人工接种橘青霉杨梅果实体内酚类代谢相关酶活性的变化，旨在阐述酚类物质代谢在杨梅果实绿霉病抗病性丧失及果实腐败过程中的作用，为解释杨梅果实采后绿霉病发病生理机制和增强防治措施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

供试杨梅采自福建省漳州市浮宫镇，采收当天用冷藏车运至实验室。挑选大小一致、无病虫害和机械损伤的果实，用无菌蒸馏水冲洗3次。晾干后将果实浸泡于橘青霉孢子悬浮液中接种，以此作为处理组。以未接种的杨梅果实作为对照组，在25℃培养箱中保温培养，每1 d取样1次，进行各指标测定。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 总酚含量测定

参照林河通等[7]的方法。取果肉2 g，经含1% HCl的甲醇溶液研磨成匀浆并抽提2 h，过滤定容，在280 nm处测定吸光值，结果以mg/g FW表示。

1.2.2 木质素含量测定

参照鞠志国等[8]方法，略有改动。取2 g果肉，用25 mL 86%（V/V）硫酸水解4 h，随后在250 mL蒸馏水煮沸1 h。真空过滤后试纸连同滤渣烘干后称重，按下列公式计算。

木质素%＝（烘干后滤纸连同滤渣总重-滤纸重）/样品重×100% （1）

1.2.3 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定

参照Duan[9]的方法。取1 g果肉，加入10 mL·0.1 mol/L硼酸缓冲液研磨成匀浆后在10000 rpm 转速离心15 min。取3 mL上清液与3 mL 0.02 mol/L L-苯丙氨酸、5 mL 0.1 mol/L硼酸缓冲液和2 mL蒸馏水混匀，在30 ℃水浴中反应30 min后用HCl终止反应。于290 nm处测定吸光值，结果以U/mg protein表示。

1.2.4 多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性的测定

参照林河通[10]和朱广廉等[11]的方法，但略有修改。称取果肉1 g于匀浆机中，加入10 mL pH ＝5.5 50 mmo1/L PBS中研磨成浆，随后15 000 rpm 4℃离心20 min，取上清液重复上述操作，制得酶液。PPO活性测定采用邻苯二酚法，取1.0 mL酶液，加入PPO反应底物液，置于35 ℃水浴中反应10 min随即终止反应，于525 nm处测定吸光值。以U/mg protein表示。POD活性测定采用愈创木酚法，取0.1 mL酶液，加入POD反应底物液，在35℃下保温15 min，随后加入2 mL 20% TCA终止反应，于470 nm处测定OD值。以U/mg protein表示。

1.3 数据处理

所有指标测定数据均重复3 次，应用SPSS数据分析软件，对数据进行差异性和相关系分析。

2 结果与分析

2.1 橘青霉侵染后杨梅果实总酚含量的变化

酚类化合物是植物体内一类重要的次生代谢物质，对植物病原菌有不同程度的毒性，与植物抗病性密切相关。从图1可以看出，杨梅接种橘青霉后的第1 d果实体内总酚含量快速增加，显著高于对照(＜0.05)。在第2 d达到峰值，同比对照增加了34%，但在随后的第3 d和第4 d果实总酚含量下降较快，甚至低于同期对照，之后始终维持较低水平。而对照组总酚含量在整个贮藏期间均变化相对平缓。

2.2 橘青霉侵染后杨梅果实木质素含量的变化

据报道，病原菌的侵染能诱导细胞快速合成木质素而在细胞壁上形成一道致密、不易穿透的物理屏障，从而限制病原菌分泌的酶和毒素在细胞内的扩散。图2表明，对照处理果实木质素的含量随贮藏期的延长呈增加趋势，但增加范围并不大，整个贮藏期间仅提高0.18%。

接种处理组果实细胞木质素含量在贮藏的第1 d下降很快，从原始0.8%迅速下降至0.526%，显著低于对照的0.85%。虽然在第3 d木质素含量有所增加，但随后第4 d又快速下降，并在贮藏后期始终处于较低水平，显著低于对照(＜0.05)。

图2 橘青霉侵染后杨梅果实木质素含量的变化

2.3 橘青霉侵染后杨梅果实多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性的变化

多酚氧化酶(PPO)可将酚类物质氧化成对病原菌具有高毒性的醌类物质，可以阻止病原菌进一步侵入[12-13]。POD是苯丙烷类代谢途径的末端酶，可参与植物体内木质素的合成，从而起到抗病菌作用。如图3所示，接种及对照处理杨梅果实PPO活性随贮藏时间延长均呈先上升后下降的趋势。区别在于对照处理PPO活性增加较为平缓，第3 d达到峰值，随后缓慢下降。而接种处理PPO活性则有两个快速增加阶段，分别出现在第1 d和第4 d，增幅分别达到53%和40%。整个贮藏期间，接种处理PPO活性整体高于对照，二者差异显著(＜0.05)。如图4所示，接种及对照处理杨梅果实POD活性出现两种不同的变化趋势。接种处理POD活性在贮藏前期增加较快，在第2 d即出现峰值38.971 U/mg protein，约为当天对照的1.5倍。随后在第3 d快速下降至30.219 U/mg protein，贮藏后期变化不大。而对照处理POD活性整个贮藏期间内则缓慢增加。

图3 橘青霉侵染后杨梅果实多酚氧化酶(PPO)活性的变化

图4 橘青霉侵染后杨梅果实过氧化物酶(POD)活性的变化

2.4 橘青霉侵染后杨梅果实苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的变化

PAL是植物体内苯丙烷类代谢途径的限速酶，催化L-苯丙氨酸脱氨生成肉桂酸，再经过各种酶促反应最终生成木质素的前体[14]。由图5可见，接种处理的杨梅果实PAL活性在第1 d快速下降，显著低于对照的53.234 U/mg protein。贮藏中后期PAL活性有所回升。而对照处理PAL活性在贮藏前2 d缓慢上升至峰值，随后略微下降，并于贮藏后期相对稳定。

图5 橘青霉侵染后杨梅果实苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的变化

3 讨论

大量研究表明，酚类化合物及其中间产物对植物病原菌都有不同程度的毒性作用[15]，植物可通过对酚类物质代谢的调节来起到抵御病原菌侵染的作用。李文娟等[16]研究发现氯化钾可提高玉米茎髓酚类物质含量，从而提高玉米茎髓抗茎腐病的能力。李磊等[17]利用高效液相色谱分析法检测出黄冠梨果皮中主要酚类物质为绿原酸，并且发现浸钙和普鲁兰多糖涂膜处理可延缓黄冠梨储藏期间绿原酸等酚类物质含量的下降速度，降低了黄冠梨鸡爪病发病率。本研究表明，橘青霉侵染杨梅后的第1 d和第2 d，果实细胞积累了大量的酚类物质，同时POD、PPO活性也快速上升。说明果实细胞对病原菌发生识别，激活细胞内防御系统，从而使果实细胞产生抗病性，防止病原菌的进一步侵入。但这种抗病性能力有限，只持续了2 d。贮藏第3 d开始，酚类物质含量不增反降，甚至低于对照水平，不能强有力地持续抑制病原菌，有利于病原菌在细胞内扩散，这可能是接种处理杨梅果实较对照易败坏的原因之一。笔者推测有两个原因：一是橘青霉分泌的某些物质可能导致贮藏中后期酚类物质合成受阻，这有待进一步证实。二是贮藏中后期POD、PPO活性不断增加，导致前期积累的酚类物质被大量降解（图3、图4）。

木质素是高等植物细胞壁的组成部分，也是一类重要的酚类物质。苯草酸在PAL的作用下发生苯丙烷类代谢，产生对香豆醇、芥子醇和松柏醇，再经POD脱氢聚合形成木质素[18]。PAL是催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，同时也是苯丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶。本研究发现，橘青霉侵染初期，虽然PPO、POD这两个与木质素合成的相关酶类活性增加，但PAL活性并没有相应增加，反而下降较快，致使木质素合成受阻，这与图2中显示的木质素含量下降表现出一致性。

4 小结

杨梅在感染橘青霉初期，通过调节杨梅果肉组织中PPO和POD活性，诱导果实体内产生大量酚类物质以提高自身的抗病能力，但这种自身调节能力有限。橘青霉感染中后期，随着酚类物质和木质素自身合成受阻及不断被降解，橘青霉更容易穿透杨梅果实细胞壁，进入植物细胞组织内繁殖生长，最终导致杨梅果实腐败。

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EFFECT ON PHENOLIC METABOLISM IN CHINESE BAYBERRY FRUIT INFECTED BY

*GUO Xin1,2, GUO Meng1,2, CHEN Lian3

（1. College of Food Engineering, Zhangzhou Institute of Technology, Zhangzhou, Fujian 363000, China; 2. The Applied Technical Engineering Center of Further Processing and Safety of Agricultural Products, Higher Education Institutions in Fujian Province, Zhangzhou, Fujian 363000, China; 3. School of Biological Science and Biotechnology, Minnan Normal University, Zhangzhou, Fujian 363000, China)

Using Chinese bayberry fruit bagged to control the latent infestation of pathogenic bacteria before harvest as the material, fruit after harvest were vaccinated by, in order to study the effects on the phenolics content and the activities of some related oxidases. The results exhibited that the activities of PPO and POD in the fruit cells of bayberry increased, and phenolics were rapidly generated to improve their disease resistance on early stage ofinfection. At the same time, the PAL activity did not increase correspondingly, but decreased rapidly, resulting in lignin synthesis blocking. It indicated that the infection ofinduced certain disease resistance of the fruits, but it was limited. Although the activity of POD decreased slightly and the activity of PPO remained stable during the middle and late storage stages, they were both always at a high level, leading to the degradation of the phenolic substances accumulated in the early stage. Combined with the blocking of lignin synthesis in the early stage,could penetrate the cell wall and enter into the cell tissue to grow and reproduction, eventually lead to fruit spoilage.

Chinese bayberry;; phenolic metabolism; disease resisitance; defense enzyme

1674-8085(2020)01-0043-05

TS255.3

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2020.01.009

2019-11-02；

2019-12-06

福建省科技计划项目（2018N2002）

*郭 欣(1984-)，女，福建闽侯人，讲师，硕士，主要从事农产品加工及贮藏研究(E-mail:623849111@qq.com);

郭 萌(1984-)，女，湖北襄阳人，讲师，硕士，主要从事食品加工技术研究(E-mail:8671840@qq.com);

陈 莲(1979-)，女，福建漳州人，副教授，博士，主要从事农产品保鲜研究(E-mail:49471170@qq.com).