miR-21作用于PTEN 与结肠癌化疗疗效关系*

刘 洁 彭 微 刘 怀 徐筱红 李媛彬 罗庚求

1 湖南中医药高等专科学校基础医学部，湖南省株洲市 412000； 2 中南大学湘雅医学院病理学系

结肠癌是我国最常见消化道肿瘤之一，随着饮食习惯的改变，近几年来结肠癌的发病率与死亡率逐年上升，且越来越年轻化。近年来miRNA的研究已成为肿瘤学领域的新热点，国内外多项研究表明在结肠癌患者组织miR-21呈高表达，并其表达与临床分期、淋巴结转移及远处转移相关，揭示miR-21作为一个致癌miRNA，在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用[1-2]。

目前治疗恶性肿瘤的主要手段仍然是手术和化疗，但是有部分患者对化疗药物不敏感，从而使化疗的疗效不明显。因此，提高恶性肿瘤对化疗药物的敏感性已经成为肿瘤研究一个重要方面，也是提高化疗疗效的主要方法。多项研究表明在多种肿瘤中包括结肠癌中miR-21高表达与治疗疗效不佳、预后差显著相关，抑制肿瘤细胞中miR-21的表达可增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性。而我们前期研究也证实结肠癌晚期患者血浆中 miR-21 表达水平不同对化疗药物的疗效也不相同，提示血浆 miR-21 有望成为预测化疗药物疗效的敏感性指标。另外在多种癌中，已证实miR-21作用于靶基因PTEN，在转录后水平调节肿瘤细胞的扩散及侵袭[3]。同时miR-21通过作用于其靶基因PTEN在许多肿瘤细胞的耐药中发挥作用[4]。

因此，我们在前期已有工作基础上从临床和细胞学两个方面进行研究，旨在提示结肠癌中miR-21和PTEN联合检测可成为有效的辅助预测化疗疗效的敏感指标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本采集:经医院伦理委员会审查通过收集株洲市中心医院经病理组织和影像学检查诊断为Ⅲ期结肠癌患者40例，其中男24例，女16例，年龄45～75岁，中位年龄58岁。这40例患者术前均未接受过任何治疗。在患者填写知情同意书后，采集这40例结肠癌患者化疗前的病理组织切片。所有患者入院后进行FOLFOX4方案化疗，化疗方案每2周重复10次，6个周期化疗后进行疗效评估。

1.1.2 细胞来源：结肠癌细胞株SW480(中国科学院上海细胞库)。

1.1.3 试剂：10%小牛血清的RPMI-1640、DMEM培养基(Gibco公司)；Lipofectamine TM 2000转染试剂(美国Invitr-ogen公司)；引物及U6内参(上海生工生物工程公司)；总RNA提取试剂盒(日本TaKaRa公司)；qPCR QuantitationKit试剂盒(上海吉玛制药技术有限公司)；PTEN抗体(美国Cell Signaling公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗、兔抗人β-actin(美国Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR法检测结肠癌组织miR-21表达：按试剂盒说明进行逆转录反应，然后开展荧光定量PCR。所有标本检测3次。以U6作为内参基因。

1.2.2 免疫组化测定PTEN表达：用已知阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。PTEN 表达于细胞核或质中，按照每个视野中阳性细胞数占全部细胞数的比例将判断标准分4级：≤10%为-，> 10%且≤50%为+，>50%且≤75 %为++，>75%为+++。

1.2.3 细胞的分组及处理：对数增殖期的SW480细胞，用浓度(0.06μg/ml)作用48h后弃去含药的培养液，加入新鲜的培养液,继续培养：待其恢复正常，消化传代后继续用0.06μg/ml的药物浓度处理48h，如此反复，每个浓度重复3～5次,然后提高浓度梯度，最终使细胞耐受浓度为0.8μg/ml，并将该株细胞始终处于0.8μg/ml顺铂作用下，以稳定耐药性能；细胞转染步骤如下：SW480细胞经过0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数增殖期细胞2×105个接种于6孔板，用250μl无血清RPMI-1640稀释LipofectamineTM2000转染试剂8μl和miR-21抑制剂12.5μl，室温静置5min，然后将转染试剂与稀释miR-21抑制剂混合，室温下静置20min后，分别铺到6孔板中，在37℃、5%CO2的培养箱培养，供后续实验使用。

1.2.4 Western blot(免疫印迹)检测PTEN蛋白:首先进行总蛋白的提取。用Bio-Rad凝胶成像显色仪行发光检测，Quantity One软件显色凝胶图像的光吸光度。以β-actin蛋白为内参照，以PTEN条带与β-actin条带吸光度值的比值表示。

1.2.5 流式细胞术测定各组细胞凋亡率:首先消化细胞，再用培养基洗脱细胞，1 000r/min离心10min收集细胞，PBS洗涤2次，75%乙醇(冰预冷)固定，流式细胞仪测定细胞的凋亡率。

1.2.6 疗效评估标准:按照WHO制定的实体瘤客观疗效评定标准分为完全缓解(Complete response,CR)、部分缓解(Partial response,PR)、疾病稳定(Stable disease,SD)、疾病进展(Progressive disease,PD)。总有效率RR为(CR+PR)%。CR或PR者4周后复查CT进行疗效确认。

2 结果

2.1 结肠癌组织中miR-21和PTEN的表达情况 miR-21在结肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.05)，见表1。PTEN表达于细胞核或浆中，呈棕黄色。PTEN在结肠癌组织中阳性率显著低于癌旁组织(P<0.05)，见表1，而且miR-21与PTEN的表达之间呈负相关(P<0.05)；另外miR-21在40例结肠癌患者的表达与肿瘤的分化程度有关(P<0.05)。

表1 miR-2和PTEN在结肠癌组织中的表达情况

注:癌旁正常组织与结肠癌组织比较,*P<0.05。

2.2 结肠癌组织中miR-21和PTEN表达与化疗药物疗效的相关性 结肠癌组织化疗前miR-21的表达在(CR+PR)组的表达量低于(PD+SD)组，而PTEN在(CR+PR)组的阳性率高于(PD+SD)组，P<0.001。见表2。

表2 化疗前组织中miR-21和PTEN表达与化疗药物疗效的相关性分析

注：两组相比，*P<0.05。

2.3 qRT-PCR检测各组细胞miR-21的表达 结肠癌细胞株SW480组(对照组)、转染miR-21抑制剂抑制组以及耐药细胞组，发现耐药细胞组miR-21表达高于对照组(P<0.001)，明显高于转染抑制组(P<0.001)，而对照组miR-21表达高于转染抑制组(P<0.001)。见表3。

表3 qRT-PCR检测各组细胞miR-21的表达

注：与对照组相比，*P<0.001;与对照组和抑制组相比，#P<0.001。

2.4 Western blot检测各组PTEN的表达 PTEN 蛋白在转染抑制组表达量为1.65±0.07，显著高于对照组的1.00±0.05(P<0.001),耐药细胞组中的表达量为0.60±0.10,显著低于对照组和转染抑制组(P<0.001)。见图1。

图1 Western blot检测各组PTEN的表达

2.5 流式细胞仪测定各组细胞的凋亡率 耐药组细胞凋亡率明显低于转染抑制组(P<0.001)，也低于对照组(P<0.001)，而对照组细胞凋亡率明显低于转染抑制组(P<0.001)。见表4。

表4 流式细胞术测定各组细胞凋亡率的比较结果

注：与对照组相比，*P<0.001;与对照组和抑制组相比，#P<0.001。

3 讨论

结肠癌是我国十大恶性肿瘤之一，其常见的治疗手段之一就是化疗，但很多结肠癌尤其是中晚期结肠癌患者的化疗效果不佳，主要原因是对化疗药物不敏感，因此提高化疗药物敏感性是当前医疗工作者急需解决的问题。

miR-21作为microRNA的一个重要分子，在多种肿瘤中表达均增高，并与肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡有密切关系。而同时发现miR-21与肿瘤的耐药也有密切关系，在多种耐药的肿瘤细胞中miR-21的表达增高。PTEN是重要的抑癌基因之一，它能够抑制肿瘤细胞的增殖、浸润、侵袭及转移，同时其也是miR-21重要的靶基因之一。抑制肿瘤细胞中miR-21的表达，PTEN表达会相应上调。研究发现，在多种肿瘤细胞中，miR-21通过下调PTEN表达水平增加肿瘤细胞对化疗药物的耐药[5-9]。

本研究从临床和细胞学两个方面进行研究：发现miR-21和PTEN的表达在结肠癌组织和癌旁组织中有差异，而且在结肠癌组织中miR-21与PTEN的表达之间呈负相关；结肠癌晚期患者进行化疗后疗效评估，发现化疗前组织miR-21的表达和PTEN的表达在(CR+PR)组的表达量不同于(PD+SD)组；细胞实验中对照组、转染抑制组以及耐药细胞组，各组细胞miR-21、PTEN的表达、细胞凋亡率都存在差异，当抑制miR-21表达时PTEN表达增高，并且耐药细胞组中miR-21表达明显高于对照组，PTEN表达则明显低于对照组，凋亡率也是耐药组最低。这些实验结果再次证实PTEN为miR-21的靶基因，另外也表明miR-21可能通过作用于PTEN来调节细胞凋亡从而参与结肠癌细胞的耐药，提示结肠癌中miR-21和PTEN联合检测可成为有效的辅助预测化疗疗效的敏感指标，为耐药的肿瘤患者带来福音，可能为肿瘤的治疗提供新的途径。