姜黄素抑制动力相关蛋白1介导的线粒体分裂抗H9c2细胞低氧复氧损伤

牟幼灵，吕京珂，赵瑞，韩丽萍，刘骞

（浙江中医药大学药学院，浙江杭州 311402）

急性心肌梗死的发病率和致死率一直居高不下，目前公认的治疗手段是恢复血流再灌注以减少梗死区心肌坏死，然而再灌注过程诱发的一系列心肌损伤却缺少有效的临床干预方法［1］。心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤是多种病理机制共同作用的结果，主要包括炎症［2］、线粒体障碍［3］、氧化应激［4］和微血管障碍［5］等。心脏的高能量需求使得心肌细胞内线粒体比例高于其他脏器，维持线粒体稳态在心肌I/R损伤的治疗中具有重要作用［6］。研究发现，心肌I/R损伤与线粒体分裂/融合动态平衡有密切关系［7］，再灌注阶段动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）激活并参与心肌细胞线粒体的过度分裂，导致线粒体片段化和功能障碍，进一步加重心肌细胞死亡［8］。因此，有效抑制线粒体过度分裂已成为I/R 损伤心肌保护的研究重点，探明线粒体稳态在心肌I/R 损伤中的作用机制将有助于减少心肌细胞死亡提高心梗患者预后。

姜黄（Curcuma longaL.）原产于印度，除作为香料外，还广泛应用于咳嗽、糖尿病性溃疡、肝胆疾病和关节炎等疾病的治疗，属于药食两用的药材［8］。姜黄素（curcumin，Cur）是姜黄的活性成分之一，具有抗炎［9］、抗氧化［10］、降糖［11］、抗衰老［12］和抗肿瘤［13］等多种药理活性。研究认为，Cur 可能通过抑制心肌细胞炎症［14］、氧化应激［15］和凋亡［16］维持心肌细胞结构和功能，通过Notch［17］和沉默调节蛋白3（silent mating type information regulation 2 homolog 3，SIRT3）［18］等信号通路减轻心肌细胞损伤并改善I/R 后心功能。有报道Cur 可减轻星形胶质细胞氧化应激造成的线粒体损伤和功能障碍［19］，对I/R 后心肌细胞线粒体也有保护作用［20］，但对线粒体形态的影响仍有待进一步研究。因此，本研究拟通过大鼠心肌细胞H9c2 低氧复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）损伤模型探讨Cur是否通过抑制线粒体分裂维持线粒体完整性和功能，从而减轻细胞凋亡并发挥心肌细胞保护作用，以期进一步揭示Cur 对心肌I/R损伤保护的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和主要仪器

Cur（CAS 号458-37-7，批号110823-201706，HPLC 纯度≥98%，中国食品药品检定研究院）；胎牛血清、DMEM 培养基和胰蛋白酶（美国Gibco 公司）；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白浓度测定试剂盒、DAPI荧光探针、ATP检测试剂盒、兔抗大鼠电压依赖性阴离子通道蛋白1（voltage-dependent anion channel protein1，VDAC1）单克隆抗体、兔抗大鼠β 肌动蛋白单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）抗体（上海碧云天生物技术有限公司）；DHE 荧光探针、Mito-Tracker荧光探针和JC-1荧光探针（美国Invitrogen公司）；Calcein-AM 荧光探针（美国Life Technologies公司）；TUNEL检测试剂盒（美国Roche公司）；兔抗大鼠细胞色素c 单克隆抗体（美国Abcam 公司）；兔抗大鼠活化胱天蛋白酶3 单克隆抗体、兔抗大鼠Drp1 单克隆抗体和兔抗大鼠丝氨酸616 位点磷酸化Drp1（phospho-Drp1，p-Drp1）单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology 公司）；Spectra-Max 190 全波长酶标仪（美国MD 公司）；Olympus IX71 荧光显微镜（日本Olympus 公司）；LSM 880共聚焦激光扫描显微镜（德国Carl Zeiss公司）。

1.2 细胞和分组

H9c2细胞（中国科学院细胞库）置37℃，5%CO2培养箱中，用含10%FBS的DMEM培养液培养。使用胰蛋白酶消化对数生长期细胞，以每孔5×103密度接种于96 孔板或以每孔5×104密度接种于6 孔板。细胞分为5组：细胞对照组、H/R组、H/R+Cur 1，5和10 μmol·L-1组；Cur预处理H9c2细胞12 h，在低氧小室内以低氧条件（94%N2∶5%CO2∶1%O2）孵育16 h，再置于正常培养环境复氧培养2 h，建立H/R损伤模型。

1.3 CCK-8法检测细胞存活率

取1.2 分组细胞，加CCK-8 溶液至每孔终浓度为10%，继续孵育2 h，酶标仪测定450 nm 处吸光度（A450nm）值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（实验组A450nm-空白组A450nm）/（细胞对照组A450nm-空白组A450nm）×100%。

1.4 LDH漏出量、SOD活性和MDA含量检测

取1.2 分组细胞，分别按试剂盒检测说明书测定细胞培养液中LDH 漏出量、细胞SOD 活性和MDA含量。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各孔细胞总蛋白量，以每g 蛋白样品中SOD 活性和MDA含量进行统计分析。

1.5 DHE 探针检测细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平

取1.2分组细胞，加DHE 荧光探针10 μmol·L-1避光孵育30 min。经PBS润洗后，荧光显微镜随机视野拍照并统计荧光强度。

1.6 MitoTracker探针检测线粒体形态、长度和密度

细胞分为3 组：细胞对照、H/R 组和H/R+Cur 10 μmol·L-1组，加MitoTracker荧光探针100 μmol·L-1染色线粒体30 min，PBS 润洗后，激光共聚焦显微镜观察各组细胞线粒体形态并拍照，检测线粒体平均长度（μm）和密度（每100 μm2内线粒体数量）。

1.7 Calcein-AM 探针荧光强度评价线粒体通透性转换孔开放程度

按1.6 分组细胞，加Calcein-AM 荧光探针1 μmol·L-1和氯化钴2 mmol·L-1孵育20 min，PBS润洗后，荧光显微镜随机视野拍照并统计Calcein绿色荧光强度，用荧光强度表示线粒体通透性转换孔开放。

1.8 JC-1探针检测线粒体膜电位

按1.6 分组细胞，加JC-1 荧光探针2.5 mg·L-1孵育20 min，PBS 润洗后，荧光显微镜随机视野拍照，JC-1 聚合体（红色）/JC-1 单体（绿色）荧光强度比值表示线粒体膜电位。

1.9 细胞内ATP含量测定

按1.6分组细胞，按试剂盒检测说明测定细胞内ATP含量。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定细胞总蛋白量，以每mg蛋白样品中ATP含量进行统计分析。

1.10 TUNEL染色检测细胞凋亡

取1.6 分组细胞，按照试剂盒检测说明测定TUNEL 阳性细胞数量，同时加DAPI 荧光探针5 mg·L-1孵育5 min，PBS润洗后，荧光显微镜随机视野拍照并统计TUNEL 阳性细胞和DAPI 阳性细胞，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率（%）=TUNEL 和DAPI双阳性细胞数/DAPI阳性细胞数×100%。

1.11 Western 印迹法检测细胞内Drp1、p-Drp1、活化胱天蛋白酶3、胞浆细胞色素c 和线粒体内细胞色素c蛋白表达

取1.6 分组细胞，使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液于冰上裂解H9c2 细胞，BCA 法测定蛋白浓度。各实验组以等量总蛋白进行SDS-PAGE分离，电泳结束后转移至PVDF 膜上。经10%脱脂牛奶封闭后，分别使用Drp1（1∶1000）、p-Drp1（1∶1000）、细胞色素c（1∶1000）及活化胱天蛋白酶3（1∶1000）一抗和相应二抗（1∶4000）检测目的蛋白，β 肌动蛋白作为细胞总蛋白的内参，VDAC1 作为线粒体总蛋白的内参，以目标蛋白与内参积分吸光度值比值表示蛋白相对表达水平。

1.12 统计学分析

所有实验均独立重复3次，使用Minitab 14 软件进行数据分析，实验结果数据以表示，进行单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Cur对H/R诱导H9c2细胞存活率的影响

如表1 所示，与细胞对照比较，H/R处理后细胞存活率显著下降（P<0.01）；与H/R组比较，H/R+Cur 5和10 μmol·L-1组细胞存活率显著提升（P<0.01）。

Tab.1 Effect of curcumin（Cur）on cell viability of H9c2 cells exposed to hypoxia/reoxygenation（H/R）injury by CCK-8 kit

2.2 Cur 对H/R 诱导H9c2 细胞LDH 漏出量、SOD活性和MDA含量的影响

如表2 所示，与细胞对照比较，H/R 处理后H9c2细胞LDH漏出增多（P<0.01），SOD活性降低（P<0.01），MDA 含量增加（P<0.01）；与H/R 组比较，H/R+Cur 5 μmol·L-1组LDH 漏出显著降低（P<0.05），MDA含量显著降低（P<0.05）；H/R+Cur 10 μmol·L-1组LDH 漏出显著降低（P<0.01），SOD活性显著升高（P<0.01），MDA 含量显著降低（P<0.01），提示Cur 10 μmol·L-1能显著减轻细胞损伤和氧化应激。

Tab.2 Effect of Cur on lactate dehydrogenase（LDH）leakage，superoxide dismutase（SOD）activity，and malondialdehyde（MDA）content in H9c2 cells exposed to H/R injury

2.3 Cur对H/R诱导H9c2细胞内ROS水平的影响

如图1 结果所示，与细胞对照（260±28）比较，H/R组细胞内ROS水平显著增加（P<0.01）；与H/R组比较，H/R+Cur 5 和10 μmol·L-1组细胞内ROS水平显著降低（P<0.05，P<0.01）。结合2.1 和2.2实验结果，Cur 10 μmol·L-1表现出显著细胞保护和抗氧化作用，因此，后续实验选择Cur 10 μmol·L-1研究其对H9c2细胞线粒体形态和功能的影响及作用机制。

Fig.1 Effect of Cur on reactive oxygen species（ROS）level in H9c2 cells exposed to H/R injury by DHE staining.See Tab.1 for the cell treatment.B was the semiquantitative result of A. ，n=6.＊＊P<0.01，compared with cell control group；#P<0.05，##P<0.01，compared with H/R group.

2.4 Cur对H/R诱导H9c2细胞线粒体形态、长度和密度的影响

如图2结果所示，与细胞对照组比，H/R组细胞线粒体分裂增加，线粒体平均长度减少（P<0.01），线粒体密度显著降低（P<0.01）；与H/R 组相比，H/R+Cur 10 μmol·L-1组线粒体平均长度增加（P<0.05），线粒体密度显著增加（P<0.05）。

2.5 Cur 对H/R 诱导H9c2 细胞线粒体通透性转换孔开放程度的影响

如图3所示，与细胞对照细胞比较（62±8），H/R组线粒体内Calcein绿色荧光强度显著降低（18±7，P<0.01），提示线粒体通透性转换孔开放增加；与H/R组相比，H/R+Cur 10 μmol·L-1组线粒体绿色荧光强度显著增加（32±8，P<0.01），提示线粒体通透性转换孔开放程度降低。

2.6 Cur对H/R诱导H9c2细胞线粒体膜电位的影响

Fig.2 Effect of Cur on mitochondrial morphology，length and density in H9c2 cells exposed to H/R injury by MitoTracker staining.H9c2 cells were treated with Cur 10 μmol·L-1 before H/R injury，and mitochondrial morphology was detected by MitoTracker（green）.A was the representative fluorescence images of mitochondrial morphology.B and C were the semi-quantitative results of mitochondrial length and density，respectively.，n=60（cells from three biological replicates）.＊＊P<0.01，compared with cell control group；#P<0.05，compared with H/R group.

Fig.3 Effect of Cur on mitochondrial permeability transition pore opening in H9c2 cells exposed to H/R injury by Calcein-AM（green）.See Fig.2 for the cell treatment.

Fig.4 Effect of Cur on mitochondrial transmembrane potential in H9c2 cells exposed to H/R injury by JC-1 staining.See Fig.2 for the cell treatment.

如图4 所示，与细胞对照比较（3.3±0.8），H/R组JC-1 红色荧光/绿色荧光强度显著降低（0.5±0.2，P<0.01），提示线粒体膜电位去极化（图4）；与H/R 组相比，H/R+Cur 10 μmol·L-1组JC-1 红色荧光/绿色荧光强度显著增加（1.5±0.5，P<0.01），表明线粒体膜电位极化水平升高。

2.7 Cur对H/R诱导H9c2细胞ATP含量的影响

如表3 所示，与细胞对照组相比，H/R 组H9c2细胞内ATP 含量显著降低（P<0.01）；与H/R 组相比，H/R+Cur 10 μmol·L-1组ATP含量显著增加（P<0.05）。

Tab.3 Effect of Cur on ATP content in H9c2 cells exposed to H/R injury

2.8 Cur对H/R诱导H9c2细胞凋亡的影响

如图5 所示，与细胞对照组相比（3.3±1.8）%，H/R 组TUNEL 和DAPI 双阳性细胞比例明显增加〔（34.9±6.8）%，P<0.01〕，提示大量心肌细胞发生凋亡；与H/R 组比较，H/R+Cur 10 μmol·L-1组细胞凋亡率显著降低〔（19.6±5.8）%，P<0.01〕。

Fig.5 Effect of Cur on apoptosis of H9c2 cells exposed to H/R injury by TUNEL staining.See Fig.3 for the cell treatment.

2.9 Cur 对H/R 诱导H9c2 细胞Drp1、p-Drp1、活化胱天蛋白酶3、胞浆细胞色素c 和线粒体细胞色素c蛋白表达的影响

如图6 所示，与细胞对照组相比，H/R 组Drp1、p-Drp1和活化胱天蛋白酶3蛋白表达明显升高（P<0.01），细胞色素c 从线粒体释放到细胞浆显著增加（P<0.01，P<0.05）；与H/R 组比较，H/R+Cur 10 μmol·L-1组Drp1、p-Drp1 和活化胱天蛋白酶3蛋白表达显著降低（P<0.05），细胞色素c 由线粒体释放到细胞浆显著减少（P<0.05）。

Fig.6 Effects of Cur on protein expressions of dynaminrelated protein 1（Drp 1），phospho-Drp 1（P-Drp1），cleaved-caspase3，cytosolic cytochrome c（Cyt c）and mitochondrial Cyt c in H9c2 cells exposed to H/R injury by Western blotting.See Fig.2 for the cell treatment.A2，B2 and C2 were the semi-quantitative results of A1，B2 and C2，respectively.VDAC1：voltage-dependent anion chanel protein 1. ，n=3.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with cell control group；#P<0.05，compared with H/R group.

3 讨论

本研究发现，Cur可显著增加细胞存活率，减少LDH 泄漏，显著增加SOD 活性，降低细胞内MDA和ROS 含量，提示Cur 能减轻心肌细胞H/R 损伤。Cur 可显著增加线粒体长度和线粒体密度，抑制Drp1激活，降低线粒体通透性转换孔开放程度和细胞色素c 从线粒体到细胞浆的释放，增加线粒体膜电位极化和细胞ATP 水平，显著降低细胞凋亡率。提示Cur 可调控线粒体过度分裂，减轻线粒体功能障碍和细胞凋亡。

线粒体是细胞内ROS的主要来源，受损的线粒体会形成“合成过量ROS-加剧线粒体损伤-ROS合成过量”的恶性循环，直至线粒体凋亡和细胞死亡。本研究发现，Cur可降低细胞氧化应激损伤，此现象可能与线粒体保护作用有关。线粒体除作为细胞能量源外，还具有调节细胞免疫、钙稳态和自噬等作用，并通过调整其形态的分裂/融合动态平衡来发挥正常功能［21］。一旦线粒体分裂/融合动态失衡，过度分裂会导致线粒体片段化，从而造成线粒体功能障碍、细胞应激以及细胞死亡［22］。本研究发现，Cur 可抑制线粒体过度片段化，维持线粒体长度，增加线粒体密度。有研究认为，线粒体分裂与Drp1 蛋白的激活密切相关［23］，Cur 可通过调节C2C12 成肌细胞［24］和衰老小鼠脑细胞［25］等多种细胞内Drp1 表达以维持线粒体分裂/融合动态平衡。本研究发现，Cur 可下调H9c2 细胞Drp1 表达和磷酸化水平，表明Cur可参与调控H9c2细胞线粒体分裂进程。线粒体作为ATP合成的主要细胞器，细胞内ATP水平是衡量线粒体功能的常用指标之一［26］，本研究发现，Cur可增加ATP含量，表明其对线粒体功能具有一定的保护作用。线粒体通透性转换孔开放程度对于维持线粒体功能具有重要作用，过度开放会导致线粒体膜电位去极化，造成线粒体功能障碍［27］。此外，线粒体通透性转换孔过度开放还会导致细胞色素c 从线粒体释放到细胞质，诱导细胞凋亡。本研究发现，Cur 可降低线粒体通透性转换孔开放程度，维持线粒体膜电位极化，减少线粒体细胞色素c的释放，降低细胞凋亡率。

综上所述，Cur 可明显改善H9c2 细胞H/R 损伤，其机制可能与抑制Drp1 介导的线粒体分裂，维持线粒体功能，减轻氧化应激和细胞凋亡有关。但本研究均是在离体细胞中进行的，尚未在动物体内进行验证，并且是否与已报道的Notch 和SIRT3 等信号通路有关，或仍有其他调控机制的参与，还有待后续深入研究。