脑微透析技术在毒品领域中的应用及展望

李锋，魏佳韵，陈园园，乔艳玲，3，李香豫，王优美，3，徐鹏，3，狄斌

（1.中国药科大学药学院，江苏南京 210009；2.国家禁毒委员会办公室-中国药科大学禁毒关键技术联合实验室，北京 100193；3.公安部禁毒情报技术中心毒品监测管控与禁毒关键技术公安部重点实验室，北京 100193）

脑微透析（brain microdialysis，B-MD）技术是一种以透析原理为基础，并结合灌流取样的脑部微量采样技术，通过与高灵敏度分析技术结合，即可对脑细胞外液物质（包括内源性和外源性）进行快速有效的定量分析，具有活体采样、采样量小、动态观察、实时监测和定量分析等特点［1-2］。美国DELGADO等［3］在1972 年首次采用B-MD 技术分析恒河猴脑内神经递质多巴胺（dopamine，DA）的释放，开启了微透析技术在脑研究领域应用的大门。20世纪90年代以来，B-MD技术已在药物研究、神经科学和肿瘤研究等领域得到广泛应用［4-6］，并不断发展和完善。2005 年，CMA600 微透析分析仪获得美国FDA 批准用于临床。此后，随着B-MD技术在脑胶质瘤研究方面应用越发成熟，国外社区医院已可以开展患者的常规B-MD监测［7］。目前，B-MD技术已应用于毒品研究领域，并取得了一些探索性的成果。

1 B-MD技术基本原理和特点

B-MD技术是一种在活体脑内进行生化微量采样的技术，可用于分析和监测脑内药物及其代谢物、神经递质、细胞因子和能量代谢产物等物质，从而研究与待测物质相关疾病的发生发展、病理过程、治疗方法和治疗效果等。在非平衡条件下，当脑组织液中待测物质的浓度较高时，这些小分子物质会扩散至埋植在脑组织中的微透析探针中，从而进入透析液。透析管内液体不断流动并通过半透膜进入待测组织，使得半透膜两侧跨膜浓度差一直存在，小分子物质会不断从脑细胞外液扩散至透析管中，再以一定的时间间隔使用微量收集管收集透析液，扩散出的小分子物质被收集后进行化学成分分析，以监测和分析脑细胞外液中各种待测物质的含量变化和释放形式，是研究脑细胞外液中待测物质浓度-时间变化的一种重要方法。

B-MD 系统由透析液、探针、微量注射泵、微量收集管及连接管等组成（图1）。透析液应与脑细胞外液渗透压相等，常用的有林格液、人工脑脊液、生理盐水和其他液体，目前实验常用的是林格液。探针是B-MD系统的核心部件，包括透析膜、进液管和出液管。根据探针的形态可分为同心圆型、水平型、Ⅰ型和U型。同心圆型探针是目前应用最广泛的，也是B-MD 适用的探针类型。微透析系统与分析系统的联用即可实现B-MD 在线分析监测的目的。常用的分析仪器有高效液相色谱-电化学检测器（high performance liquid chromatography with electrochemical detector，HPLC-ECD）、高效液相色谱-荧光检测器（HPLC with fluorescence detector，HPLC-FLD）、液相-质谱联用（liquid chromatography with mass spectrometry，LC-MS）、高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE）等。生产微透析设备的公司主要有美国的BAS公司、瑞典的CMA公司和日本的EICOM公司。

图1 脑微透析系统示意图.

目前，可用于研究脑内药物浓度和神经递质变化的技术还有正电子发射断层扫描技术和磁共振波谱分析技术［8-9］。相比这2种技术，B-MD技术具有无需标记、时间分辨率高、空间分辨率高、操作较简单和成本较低等优势［10］，因而愈发受到研究人员的关注，应用范围得到不断地拓展。但B-MD 技术也存在一定的缺点，如手术对脑组织有一定损伤性、采样量少和待测物质浓度低等。

2 B-MD技术在毒品领域中的应用

2.1 B-MD技术在毒品脑局部药动学研究中的应用

毒品脑局部药动学（pharmacokinetics，PK）是研究毒品在生物体脑内的过程，定量分析毒品在脑内所发生的变化及变化规律，是毒品研究的重要组成部分。传统脑局部PK研究通常是按一定时间间隔将动物处死后取脑组织匀浆进行处理分析，这种技术只能得到固定时间点的脑组织中待测物质浓度，且消耗实验动物多、误差大。B-MD技术可快速实时监测脑细胞外液中待测物质，并可减少实验动物数量，克服动物个体差异造成的实验误差，在脑局部PK研究中发挥越来越大的作用［11］。海洛因被认为是最易成瘾的滥用毒品之一，由于海洛因与μ 阿片受体结合力低而被认为是前药，其产生主要药效的代谢产物是吗啡还是6-单乙酰吗啡（6-monoacetylmorphine，6-MAM）存在很大争议。GOTTAS等［12］通过微透析（包括B-MD技术）分析了大鼠的血液和脑细胞外液中海洛因及其代谢物的浓度。大鼠静脉注射0.1 mL海洛因（12.8 g·L-1）后，血液和脑细胞外液中的海洛因含量快速下降，分别在18和10 min后无法检测到；6-MAM含量迅速升高，分别在2.0和4.3 min后达到最大浓度；吗啡含量的升高非常缓慢，分别在12.6和21.3 min后才达到最高水平，仅为6-MAM 最高浓度的1/6，并且吗啡浓度在大鼠注射海洛因30 min 后才超过6-MAM 浓度。因此，6-MAM可能介导了海洛因产生的大多数效应。

苯丙胺类毒品是一类被广泛滥用的中枢神经兴奋剂，这类毒品的奖赏和强化作用可能是由改变转运蛋白功能从而增加细胞外DA 水平所介导的。VAN GAALEN 等［13］开发了一种基于微透析技术（包括B-MD 技术）的PK 和药效学（pharmacodynamics，PD）模型，用群体分析法研究了D-苯丙胺在大鼠和食蟹猴血浆、脑细胞外液和脑脊液中的PK，然后将该PK 模型与B-MD 测量纹状体细胞外DA 的PD 模型相关联。通过B-MD 技术研究发现，在大鼠和食蟹猴脑中，D-苯丙胺通过转运蛋白诱导DA 外流（反向转运）是导致DA 剂量依赖性增加的主要原因，且2物种之间的PK/PD 模型结构是一致的。这种基于微透析技术的PK/PD 模型在指导苯丙胺类物质成瘾的治疗方法筛选中具有更大的价值。N-乙戊酮（N-ethylpentylone，NEP）是世界上缴获最多的合成卡西酮类物质之一，其PK还不清楚。LIN 等［14］通过B-MD 评估了大鼠伏隔核（nucleus accumbens，NAc）中NEP 的PK，同时监测了NEP的血浆浓度。研究结果发现，NEP迅速通过血脑屏障，并在给药后约40 min达到最大浓度（Cmax）。血浆中约4%NEP分布到NAc，考虑到大脑的均匀分布，血浆中超过90%NEP可能分布到了大脑。

2.2 B-MD技术在毒品成瘾机制研究中的应用

毒品成瘾是一种涉及脑部奖赏、动机和学习记忆的慢性复发性脑部疾病，与脑内多种神经递质系统的功能紊乱密切相关［15］。DA系统的改变是毒品成瘾的重要生物学基础，但近年来，5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲肾上腺素、谷氨酸和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）等神经递质也开始受到研究者关注［16-19］。以往对脑内递质含量的检测多采用脑组织匀浆结合分析化学方法，其存在无法动态监测且不能直接反映脑内递质含量等问题。B-MD 技术可动态监测递质浓度，并能实时反映脑内的递质含量［20］。Shati/Nat8I 是甲基苯丙胺（methamphetamine，Meth）诱导产生的新型N-乙酰基转移酶，在前额叶皮质的表达水平明显高于其他脑区。HADDAR 等［21］研究显示，内侧前额叶皮质（medial prefrontal cortex，mPFC）中Shati/Nat8l 过表达使Meth 诱导的条件性位置偏爱（conditioned place preference，CPP）有所减弱，通过B-MD 技术分析发现，Shati/Nat8I 的过表达降低NAc细胞外DA的水平，并抑制Meth诱导的NAc中DA 的增加。上述结果表明，mPFC 中的Shati/Nat8I过表达通过降低NAc中的细胞外DA浓度而减弱了Meth诱导的CPP。

已知3，4-亚甲二氧基甲基苯丙胺（3，4-methylenedioxymethamphetamine，MDMA）可诱导人类产生依赖性，而脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）参与中脑多巴胺能神经元的突触可塑性和神经营养。MOURI 等［22］发现，小鼠MDMA 重复给药7 d 可诱导海马和纹状体中BDNFmRNA表达，而在BDNF基因缺失的小鼠中，MDMA诱导的CPP、行为敏化均被减弱，并通过B-MD 技术分析发现MDMA 诱导NAc 细胞外5-HT和DA水平增加也均被减弱。这些结果表明，BDNF通过激活中脑5-HT能神经元和DA能神经元促进了MDMA诱导的依赖性。合成大麻素JWH-018是大麻素受体（cannabinoid receptor，CB）激动剂，与CB1和CB2的亲和力比四氢大麻酚更高，但关于其奖赏效应和滥用潜力的神经生物学机制的数据却很少。DE LUCA等［23］通过B-MD技术研究发现，大鼠静脉注射JWH-018 0.25 mg·kg-1增加了NAc 壳部中DA 释放，但不增加NAc 核心部和mPFC 中DA释放，这些作用被CB1拮抗剂（SR-141716A和AM 251）阻断，JWH-018 20 和30 mg·kg-1分别诱导了大鼠和小鼠的自身给药行为。总之，JWH-018与大麻活性成分四氢大麻酚相似，都是通过激活CB1和诱导DA 释放发挥作用。甲卡西酮（methcathinone，MC）和3-氟甲卡西酮（3-fluoromethcathinone，3-FMC）均是合成卡西酮类物质，MC和3-FMC是否影响纹状体中神经递质水平尚不清楚。WOJCIESZAK等［24］研究显示，MC 和3-FMC 均剂量依赖性增加小鼠水平运动，并通过B-MD 技术发现它们也均能剂量依赖性升高小鼠纹状体中细胞外DA 和5-HT水平，而选择性多巴胺D1受体拮抗剂SCH23390 可消除这2 个药物的作用。因此推断，MC和3-FMC诱导的自发活动是通过DA能神经元的激活介导的。

2.3 B-MD技术在戒瘾治疗方法研究中的应用

毒品成瘾机制非常复杂，目前多数毒品成瘾机制尚不明确，也缺乏理想的戒瘾治疗方法。利用B-MD 技术监测药物和神经递质的含量及变化，可评估药物和其他治疗方法在脑内的作用机制及治疗效果，为优化治疗方法提供实验依据。大剂量美沙酮维持疗法可有效减少阿片类药物成瘾患者的可卡因滥用，但尚不清楚是由于美沙酮抑制了可卡因的作用还是影响了成瘾患者对可卡因的渴求。LERI 等［25］研究发现，大剂量美沙酮维持疗法（每天30 mg·kg-1，sc）可明显抑制大鼠可卡因自身给药行为，但通过B-MD 技术分析发现会增强可卡因诱导的纹状体细胞外DA含量的升高。这表明大剂量美沙酮可减少阿片类药物成瘾患者的可卡因滥用，并可能在可卡因戒毒治疗中发挥重要作用。

pseudoginsenoside-F11（PF11）是从西洋参中分离得到的一种三萜皂苷，对Meth 成瘾的作用及机制尚不清楚。FU 等［26］研究发现，PF11（每天8 mg·kg-1，po）减弱Meth（1 mg·kg-1，sc）诱导小鼠的自发活动和CPP。通过B-MD 技术分析发现，PF11 和Meth 联合使用，可降低Meth 诱导的NAc细胞外DA 的增加，并能增加NAc 细胞外GABA 水平。上述结果表明，PF11通过调节DA能神经元和GABA 能神经元抑制Meth诱导的成瘾行为。胃饥饿素已被证明在食物奖赏、酒精摄入和几种兴奋剂奖赏中起关键作用。SUSTKOVA-FISEROVA等［27］通过B-MD技术研究显示，胃饥饿素拮抗剂JMV2959预处理可逆转芬太尼（30 mg·kg-1，sc）诱导的NAc中大麻素的增加，增强芬太尼诱导的2-花生四烯酰甘油水平，显著降低芬太尼引起的NAc 细胞外GABA 外排，并同时抑制芬太尼诱导的成瘾行为。胃饥饿素拮抗剂是否可预防阿片类药物的成瘾还需进一步研究。针灸已被证明是一种治疗药物成瘾的有效干预手段。JIN等［28］评估了神门穴（HT7）针灸对大鼠可卡因自身给药行为和VTA 中GABA能神经元活性的影响，并利用B-MD 技术测定了中脑腹侧被盖区（ventral tegmental area，VTA）中GABA 和NAc 中DA 含量。结果发现，HT7 针灸可显著逆转可卡因抑制大鼠VTA 中GABA 释放和GABA 能神经元放电速率，并抑制可卡因诱导的大鼠自身给药行为和VTA 中DA 释放。上述结果表明，针灸可通过激活VTA 中GABA 能神经元，抑制可卡因诱导大鼠NAc 中DA 的释放以及自身给药行为。

3 结语

毒品成瘾涉及脑部奖赏、动机和学习记忆等高级神经活动，其机制非常复杂，相关研究还不够深入，也缺乏理想的戒瘾治疗方法。B-MD技术具有活体采样、动态观察、实时监测和定量分析等特点，随着B-MD技术和商业化大分子截留透析膜（100 ku～300 Mu）的发展，以及多位点微透析技术在毒品研究中的应用，为进一步开展毒品脑内PK、成瘾机制和成瘾治疗等研究提供了更多可能［29-30］。基于B-MD技术的独特优势及其在其他领域的应用经验，B-MD技术将在以下毒品研究中得到广泛应用：①检测与成瘾相关的神经递质，探讨神经递质与不同毒品成瘾性的关系，并进行量化，为不同种类毒品的依赖性折算提供实验依据；②毒品在脑内的有效活性成分和生物标志物的发现及监测；③吸毒成瘾患者脑内微环境代谢变化及其机制研究；④毒品在体内时效滞后现象及不同脑区的转运情况研究；⑤多位点微透析技术连续监测多个脑区的不同神经递质，探索不同脑区的神经递质变化以及脑内各种神经递质之间的关系等。

综上，B-MD技术结合分析系统，如HPLC-ECD，HPLC-FLD，LC-MS 和HPCE，或非侵入性成像技术，如正电子发射断层扫描技术和磁共振波谱分析技术，以及生化分析仪和免疫组化染色仪等，可动态监测脑细胞外液物质，为研究脑内特定部位的药物浓度、神经递质和细胞因子的变化、能量代谢产物等提供了有效的技术手段。虽然B-MD技术存在手术对脑组织有一定损伤性、相对回收率低、透析液量少和待测成分的分离与检测较为困难等问题，导致该技术的应用也存在一定的局限性，但随着探针回收率的不断提高、高灵敏分析仪器的不断发展以及联用技术的不断完善，B-MD技术凭借其独特的技术优势，在毒品研究中的应用前景会越来越广阔。