磁性四苯乙烯基高分子双功能胶束的合成及性质

曹益华，刘 安，王李新，高建纲，林 英

(安徽工程大学 生物与化学工程学院，安徽 芜湖 241000)

聚集诱导发光(AIE)材料与传统生色团的聚集诱导猝灭(ACQ)不同，它在稀溶液中会发出微弱的荧光信号，但在聚集状态下荧光信号显著增强。自从2000年唐本忠[1]发现了这类具有AIE特点的发光材料以来，它们已经引起了广泛的关注。其中，四苯乙烯基(TPE)类衍生物因其发光性能优异、合成简便、易官能团化、AIE效应显著等优点，倍受研究者的青睐。

TPE的可塑性很强，可以连接不同的亲水或疏水基团、不同的小分子和高分子结构，因此近年来在化学传感[2-4]、生物探针[5-8]等领域的应用研究上不断取得突破性的进展。例如：Dong[9]设计合成了一种TPE衍生物，他们将ClO-与1-甲基-1，2-二氢吡啶-2-硫酮的特异反应与四苯乙烯基化合物的AIE特征相结合，设计出的荧光探针可以对ClO-具有非常强的选择性和检测性；Li[10]等设计了一种基于苯硼酸和苯酚的酸度差异来检测葡萄糖的荧光探针。通过加入葡萄糖和葡萄糖氧化酶，产生的H2O2将苯硼酸转化为弱酸性苯酚，降低了聚合物阴离子的负电荷，导致TPEA的分解，从而聚集诱导发光。新型的葡萄糖的荧光探针能在4～50 μM范围内检测葡萄糖，最低检测限为2.6 μM，并具有良好的选择性，现已成功地应用于血糖检测。

近年来，为了实现细胞内和活体高灵敏度标记，各种策略被用来制备出大量双功能及多功能成像的高分子复合组装体。尤其是，唐本忠、刘斌和史向阳等课题组在该领域的深度研究引起了广泛关注[11-13]。例如：主动靶向基团修饰的聚合物包覆荧光染料或量子点形成纳米组装体，提升了其对病变部位富集成像性能[11]。聚合物通过与超顺磁性纳米颗粒、金纳米棒的非共价作用得到双成像功能的纳米复合物，能够从磁共振造影(MRI)及计算机断层扫描(CT)双角度提供清晰的组织分析成像[13]。虽然也有利用共轭结构AIE材料与磁性纳米粒子整合制备荧光-磁性纳米复合物探索，但结果探针的荧光效率仍然不尽如人意，而且探针复合体的粒径还难以控制。

基于上述分析，研究合成以四苯乙烯基(TPE)为基础，四条臂上可控连接疏水的聚己内酯(PCL)和亲水的聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)的高分子材料，并通过两亲性自组装的方式包裹Fe3O4NPs，合成了一种具有聚集发光和磁性双功能的高分子复合材料，合成的高分子复合材料具有良好的稳定性、磁性和聚集诱导发光性能，在生物的高灵敏度标记方面应用潜能巨大。

1 实验部分

1.1 试剂

4，4′-二氨基二苯甲酮(分析纯，阿拉丁试剂公司);ε-己内酯(CL，使用前用氢化钙除水干燥后，减压蒸出)、乙烯基吡咯烷酮、Sn粉、二环己基碳二亚胺(DCC)(分析纯，上海泰坦化学品有限公司)；2-溴丙酸、乙基黄原酸钾(分析纯,TCI公司)；辛酸亚锡、二氯甲烷、乙酸乙酯、己烷、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、二苄醚、1,2-十二烷二醇、油酸(分析纯，中国医药(集团)上海试剂公司)。

1.2 实验过程

(1)4，4′，4″，4‴-四氨基四苯乙烯(TPE-AM)的合成。TPE-AM是由4，4′-二氨基二苯甲酮通过Mcmurry偶联反应得到。具体操作：依次向250 mL的三颈烧瓶中加入4，4′-二氨基二苯甲酮(0.800 g)和浓盐酸(35 mL)，升温至60 ℃下搅拌溶解，待溶解完全后，加入锡粉(3.000 g)，然后升温至75 ℃，搅拌回流9 h后，冷却至室温。抽滤后，用1 mol/L的NaOH溶液(25 mL)洗涤，抽滤，重复两次，然后用25 mL的去离子水洗涤，抽滤两次，得到黄色的粉末，滤粉真空干燥，得到产物，即TPE-AM(0.685 g)。

(2)TPE-PCL的合成。TPE-PCL是由TPE-AM与ε-己内酯(CL)开环聚合得到。总共按照不同分子量要求投料(如：5 K,10 K,15 K,20 K,25 K)合成了5种链长的TPE-PCL。以10 K分子量的合成为例，具体操作：向100 mL的磨口球瓶反应瓶中加入TPE-AM(0.0743 g)，甲苯(20 mL)，搅拌升温至140 ℃，共沸除去大部分甲苯，残留5 mL左右时迅速换成聚合装置，密闭换气阀，冷却至室温，再加入ε-己内酯(1 mL)，换Ar23次，加入辛酸亚锡(9 uL)，升温至110 ℃，搅拌下反应48 h。反应完全后，冷却至室温，加入10 mL的二氯甲烷溶解，后加入到冷己烷(200 mL)中沉淀，抽滤，重复两次，固体以乙醚(150 mL)洗涤3次，真空干燥。

(3)TPE-PCL-RAFT的合成。TPE-PCL-RAFT通过TPE-PCL与乙基黄原酸酯化合成，其中，据文献[14]报道乙基黄原酸(XA)可以由乙基黄原酸钾和2-溴丙酸反应制得。具体操作：向100 mL的磨口球瓶反应瓶中加入TPE-PCL(0.05 mmol)和甲苯(40 mL)，共沸至2 mL左右，冷却至室温。将DMAP(0.6 mmol)和乙基黄原酸(2 mmol)溶于5 mL二氯甲烷，搅拌下注入体系，密封后换气3次。将DCC(2 mmol)溶入5 mL二氯甲烷中，注入体系。室温搅拌48 h。抽滤除去不溶物，滤液旋蒸至3～4 mL,之后缓慢滴入300 mL冷无水乙醚中，边滴边搅拌，静置半天后抽滤，滤渣用4 mL二氯甲烷溶解后加入20 mL冷甲醇，搅拌5 min抽滤；再重复溶解沉淀两次，最终产品真空干燥。

(4)TPE-(PCL-b-PVP)的合成。TPE-(PCL-b-PVP)是由TPE-PCL-RAFT与乙烯基吡咯烷酮(NVP)通过RAFT聚合得到。投料控制两种链长聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)的嵌段，分别为40 K和160 K，从而合成了10种两类嵌段链长各异的星形共聚物。以TPE-PCL(10K)-b-PVP(40 K)的合成为例，具体操作：向100 mL的磨口球瓶反应瓶中加入TPE-PCL-RAFT(0.247 5 g,Mn=10 650),NVP(1 mL)，AIBN(5 mg)，瓶口用橡胶塞塞紧，Ar2换气3次，80 ℃下搅拌8 h，冷却至室温。加5 mL的THF溶解，然后加入到150 mL的冷己烷中，抽滤，重复两次，室温真空干燥24 h。干燥完后将产物取出，溶于200 mL的乙酸乙酯，用来除去均聚物PCL，离心干燥，重复3次，室温真空干燥24 h。干燥完后产物取出，溶于200 mL的去离子水，用来除去均聚物PVP，离心干燥，重复3次，最终产物室温真空干燥24 h。

(5)四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4NPs)的制备。根据报道的溶剂热法合成磁性Fe3O4NPs[15]：将乙酰丙酮铁(2 mmol)加入到二苄醚(20 mL)与1,2-十二烷二醇(10 mmol)、油酸(6 mmol)的混合溶液中，并在氮气下加入油胺(6 mmol)，加热至200 ℃，反应2 h，然后以20 ℃/min的速度升温至300 ℃后，老化1 h。冷却至室温后，得到深棕色混合物。在空气中用乙醇沉淀离心，得到深棕色物质。将产物溶解在己烷中，并用乙醇再沉淀，得到Fe3O4纳米颗粒。

(6)荧光纳米胶束与双功能性纳米胶束的合成。高分子及其复合纳米胶束在超声辅助下，一步简单自组装而制得。关于荧光纳米胶束合成，取10 mg星形嵌段共聚物溶解于1 mL二甲亚砜(DMSO)中，之后在超声辅助下滴入6 mL的去离子水中，继续以250 W功率超声100 s，获得泛蓝光乳液。过滤除去不溶物后，在去离子水中透析24 h，得到的荧光纳米胶束贮存待用。双功能性纳米胶束的合成操作如下：100 mg星形嵌段共聚物溶解于10 mL的DMSO中，0.5 mg的磁性Fe3O4NPs被均匀分散在2 mL二氯甲烷溶液中，超声辅助下将上述两种溶液滴入50 mL的去离子水中，继续以250 W功率超声100 s，获得灰色乳液。滤去不溶物后，减压蒸除二氯甲烷，在去离子水中透析24 h，得到双功能性纳米胶束贮存待用。

1.3 测试与表征

核磁共振波谱采用AVANCE Ⅲ HD 600 MHz型(Bruker)核磁共振仪测定，四甲基硅烷作为内标，氘代氯仿作溶剂。凝胶渗透色谱(GPC)采用Waters 515测定，检测器为Waters 2487紫外检测器，Wyatt Technology Optilab rEX示差折光检测器。流动相为四氢呋喃，流速为1.0 mL/min，检测温度为35 ℃。样品的X射线粉末衍射(XRD)分析在Bruker D8衍射仪上进行，使用铜靶(Kα=0.154 18 nm)作为X射线发射源。通过透射电子显微镜(TEM)(HT-7700,Hitachi)观察纳米胶束的整体形貌。纳米胶束的平均粒径由Brookhaven BI9000AT动态光散射仪(DLS)测得，所有结果取3次测试平均值。纳米胶束的荧光发射通过Hitachi F-4500荧光光谱仪获得。荧光光谱仪激发和发射单色器的狭缝宽度都设定为5 nm，荧光光谱的测试样品液均置于1 cm宽度的石英皿中。

2 结果与讨论

2.1 星形共聚物TPE-(PCL-b-PVP)的合成

作为内核的四氨基四苯乙烯(TPE-AM)根据前人的报道[16]利用4,4′-二氨基二苯甲酮通过Mcmurry偶联反应一步简单制成。星形共聚物TPE-(PCL-b-PVP)的合成过程如图1所示。采用具有强反应活性的TPE-AM作为引发剂，以辛酸亚锡为催化剂，对ε-己内酯(CL)进行开环聚合反应得到以四苯基乙烯为内核的星形聚ε-己内酯。然后，由酯化将乙基黄原酸引入聚己内酯链末端作为介导试剂，AIBN引发乙烯基吡咯烷酮RAFT聚合制得基于TPE的具有双亲性的嵌段星形聚合物。至此，研究完成了具有星形结构且带有荧光功能的共聚物的合成。

图1 星形共聚物TPE-(PCL-b-PVP)的合成路线图

小分子发光核TPE-AM和星形聚己内酯的化学结构以核磁共振氢谱分析如图2所示。由图2可以看见，氨基四苯乙烯的特征峰(δHa=6.82 ppm,δHb=6.43 ppm,δHc=3.54 ppm)，说明该化合物结构正确。此外，进一步开环聚合所得产品展现了明显的聚己内酯的特征峰(δHd=2.30 ppm,δHe=1.64 ppm,δHf=1.38 ppm,δHg=4.05 ppm)，证明星形聚己内酯化合物已经被成功合成。根据谱图分析，聚己内酯末端连羟基的CH2(δHg)的化学位移在4.05 ppm，而每条己内酯直链上的连氧原子的氢化学位移在3.64 ppm。因每条直链的末端仅有一个羟基，所以可以利用聚己内酯末端连羟基的CH2(δHg)积分值与聚己内酯末连氧原子的氢峰的积分值计算聚己内酯的分子量[17]。

图2 TPE-AM和TPE-PCL的核磁共振氢谱

图3 5种不同分子量TPE-PCL的GPC曲线

为使后续的自组装过程能够良好地包裹功能纳米粒子，同时降低组装体的荧光性能，控制作为引发前体的TPE-AM与单体ε-CL的投料比，合成了分子量不同的5种星形聚己内酯(5 K，10 K，15 K，20 K，25 K)。结合氢核磁共振谱的计算结果，GPC色谱分析5种产物的分子量及其分布如表1所示，且两种技术分析的结果基本一致。5种星形聚己内酯的分子量按投料量的增加从5.6K增长至23.2K，基本接近反应设计的理论分子量。5种不同分子量TPE-PCL的GPC曲线如图3所示。由图3可知，所有聚合物在色谱图上表现为一个单峰。

表1 5种不同链长的TPE-PCL分子量及分布

通过乙基黄原酸介导RAFT聚合将亲水的PVP链段接入聚合物，控制星形聚己内酯与NVP单体的投料量，进而合成了10种两嵌段链长不同的双亲性星形聚合物。根据核磁共振氢谱分析，计算得到10种星形嵌段共聚物的分子量如表2所示。将这些共聚物分别有序地记作S1，S2，S3,…,S10，表2中显示的分子量基本接近理论值且符合嵌段共聚物的链长设计趋势。

表2 10种不同嵌段长度共聚物TPE-(PCL-b-PVP)的分子量

星形共聚物S8和S7的核磁共振氢谱如图4所示。由图4可知，聚己内酯的部分特征峰(δHe=4.05 ppm)和聚乙烯基吡咯烷酮的部分特征峰(δHl+δHk=2.96～4.01 ppm)，其余基团的峰在1.3～2.54 ppm产生了堆积，充分证实了其嵌段共聚物的结构。在已知聚己内酯分子量的前提下，通过PVP的两种甲基CH2(δHl)+CH(δHk)的总积分值与聚己内酯末端连氧的CH2(δHe)积分值的比值能计算出TPE基双亲性星形聚合物的分子量。很明显，图4中嵌段共聚物S8的亲水PVP链聚合度远大于聚合物S7上的对应链段。

图4 星形共聚物S8和S7的核磁共振氢谱

2.2 荧光纳米胶束和双功能胶束的合成及表征

将星形两亲共聚物TPE-(PCL-b-PVP)溶于DMSO后，在超声辅助下滴入去离子中得到透蓝光的乳液，表明已组装成高分子纳米胶束。星形嵌段共聚物S8组装所得纳米胶束的透射电镜图片如图5所示。由图5可知，纳米胶束规则的近球形的形貌、均匀的尺寸和良好的分散性，由对TEM结果中150个胶束进行测算统计得其粒径约为56.7 nm。调控星形共聚物疏水链段和亲水链段的长度，以获得亲疏水链长不同的10种化合物，达到调控最终自组装所得纳米胶束尺寸的目的。因此，源自这10个星形嵌段共聚物的纳米胶束水合粒径如图6所示。纳米胶束的水合粒径总体表现为随疏水链段的增长先增大后减小再增大。究其原因，在亲水链段占优势时，多臂嵌段聚合物在水中以单分子胶束形式存在，增加疏水链段长度引起胶束聚集多分子化，持续增长疏水链导致胶束内核收缩降低粒径，之后内核因疏水链继续堆积而增大胶束体积[18]。为后续包裹磁性颗粒用作生物标记探针，选择星形嵌段共聚物S8进一步进行胶束组装并完成性能研究。

图5 星形共聚物S8组装的纳米胶束TEM图 图6 不同星形共聚物组装胶束的平均水合粒径

利用溶剂热法一步简单制备了磁性Fe3O4NPs，其XRD图谱如图7所示。纳米颗粒的所有衍射特征峰都很好地匹配了Fe3O4标准衍射卡片数据(JCPDS No.19-0629)。而后，超声辅助星形嵌段共聚物S8与Fe3O4NPs自组装，形成了灰色乳液，即制得了双功能纳米胶束。根据双功能纳米胶束粉末的XRD图谱，25°后的衍射峰位置和形状与纯Fe3O4NPs一样，仅因复合胶束内磁性颗粒量较少而令衍射峰强有所减弱。因此，证明磁性颗粒确实被组装进入了纳米胶束而结构未变。所得双功能纳米胶束的TEM图如图8所示。无机颗粒极高的电子密度让人很容易观察到其在胶束内的位置。由图8可知，纳米胶束光滑的表面及球形结构，进一步说明磁性Fe3O4NPs被有效地组装进入纳米胶束并生成了荧光磁性双功能纳米胶束。该纳米胶束的水合粒径约为365 nm，如图9所示。聚合物链的干态收缩导致了DLS所得水合粒径小于电镜观测的结果。

图7 磁性Fe3O4 NPs和双功能性纳米胶束的XRD谱图 图8 双功能性纳米胶束的TEM图

图9 双功能性纳米胶束的水合粒径分布

2.3 荧光纳米胶束和双功能胶束的性质

四苯基乙烯自身固有的聚集诱导发光性质赋予了双功能纳米胶束的荧光标记性，故而必须考察小分子核及各种星形嵌段共聚物的纳米胶束的光学性质和发展趋势。小分子TPE-AM溶于良溶剂DMSO中获得澄清溶液，在410 nm处有一个弱的荧光发射峰。由聚合反应得到的星形嵌段共聚物在不良溶剂中组装，所得各种胶束粒子的荧光光谱如图10所示。由图10可知，随着嵌段共聚物的生长和组装，聚集所得的发射波长红移至488 nm(主要是由连接苯的氨基形成酰胺键和聚己内酯参与的堆积态等因素引起)。星形共聚物内疏水链段的增长导致苯环在纳米胶束中内旋转受限越来越严重，因而其荧光发射峰强度逐渐增大。星形聚合物的纳米胶束液在白光和紫外光照下的情形如图11所示。由图11可知，星形共聚物纳米胶束由白光转到紫外光照射下，显示出明亮的荧光发射，昭示着星形嵌段共聚物因聚集自组装生成纳米胶束的同时伴生了极强荧光发射。

图10 等TPE浓度下各种荧光纳米胶束及小分子的荧光光谱(λex=352 nm) 图11 星形聚合物的纳米胶束液在白光(左)和紫外光(右)照下的照片

如前所述，选择星形共聚物S8与磁性Fe3O4NPs因自组装得到双功能纳米胶束，其荧光光谱与纯S8组装的荧光纳米胶束光谱对比如图12所示。由图12可知，相比于空的荧光纳米胶束，双功能纳米胶束的荧光发射峰因磁性颗粒裹入而稍有红移，位于500 nm处。双功能纳米胶束的发射峰强比空荧光纳米胶束降低了35%，但不影响其生物成像的使用功能。另外，双功能纳米胶束的紫外光照图片显示出其仍保留了较强的荧光亮度如图13所示,进一步证明了其作为双功能成像材料的荧光特征。拥有磁共振成像造影功能的磁性从另一个角度赋予双功能纳米胶束生物成像功能，促使该纳米胶束以高灵敏度优势在生物标记领域表现出巨大的应用潜能。

图12 星形聚合物浓度相等的荧光纳米胶束与双功能纳米胶束的荧光光谱(λex=352 nm) 图13 双功能纳米胶束在白光(左)和紫外光(右)照下的照片

3 结论

研究采用ROP和RAFT协同聚合的方式成功合成了星形嵌段共聚物TPE-(PCL-b-PVP)，通过控制反应投料比调控了嵌段共聚物的亲疏水两个链段长度和分子量。不同分子量星形共聚物自组装获得粒径各异的纳米胶束，且荧光强度随疏水链段的增长而增强。为利于后续材料的生物成像应用，以形成最小粒径胶束的星形共聚物与Fe3O4NPs自组装成具有荧光和磁性能的高分子双功能纳米胶束，该胶束的水合粒径为365 nm。双功能胶束保持了TPE内核的聚集发光性，磁性颗粒可以用于增强磁共振成像，且胶束表面的PVP链具有优良的生物相容性，使所合成的双功能纳米胶束有望成为双模态的高灵敏生物标记和成像的优秀应用平台。