基于GC-IMS技术分析糙米储藏过程中风味物质变化

王熠瑶,张烝彦,孙俊,常亚飞,吕飞,丁玉庭,周绪霞*

1(浙江工业大学 食品工程与质量控制研究所，浙江 杭州，310014)2(杭州市粮油中心检验监测站，浙江 杭州，310014)3(杭州市粮食收储有限公司，浙江 杭州，310014)

糙米因内保护皮层粗纤维保留较完整，富含多种维生素、矿物质、抗氧化成分等营养物质和谷维素、生育酚、阿魏酸和生育三烯酚等植物化学成分，越来越多成为健康人士追求并长期选择的绿色食品[1-5]。但由于失去稻壳的保护，糙米在储藏过程中易随着储藏期的延长而发生品质变化，逐渐失去了原有的特征香味，产生各种腐败、霉异味等不良气味。通过对糙米中酮类、醛类、酯类、醇类、烃类、有机酸类以及杂环类化合物等挥发性成分的测定，可以鉴定和分析出不同储藏状态和不同新鲜度糙米的挥发性成分及其含量的变化差异[6]。因此，挥发性风味物质是评价储藏过程中糙米品质变化的一项重要指标[7-8]。

目前分析糙米挥发性风味成分的技术有电子鼻技术、气相色谱-质谱联用、顶空固相微萃取-气质联用技术等[9]。电子鼻技术具有客观、操作简单、重现性能良好等优势，但存在精度低、传感器易漂移等缺点。气相色谱-离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)作为一种新的联用技术，样品分子通过GC预分离后，经过氚源软电离产生分子离子，在漂移管进行常压二次分离[10-12]。相比于气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)，其分离能力更强，大大降低了仪器成本，同时也避免了耗时久、操作复杂、碎片离子解谱困难等缺点。通过将气相分析技术和离子迁移谱巧妙有机结合，GC-IMS可快速、简捷、直观地对检测结果进行高精度分析，且不需要样品前处理和加热过程，可最大程度保留样品原有的风味信息，使分析结果更具真实性和说服力[13-16]。GC-IMS技术已越来越多的应用于农残检测、食用油品质鉴定、蜂蜜掺假鉴别、水产品新鲜度评估等食品领域，但涉及与粮食作物有关的研究颇为少见[17-22]。韩国农业推广中心采用GC-IMS技术研究发现2-乙酰基-1-吡咯啉是香米中香味物质的主要来源，通过对比其含量高低可判别香米等级[23]，但目前尚未应用于粮食新鲜度的评价中。

本文首次采用GC-IMS技术对不同储藏环境和不同储藏时间糙米中挥发性有机物质的差异信息进行分析，以期为快速判别糙米储藏过程中品质变化特别是新鲜度变化提供一种新的思路和检测方法，同时为基于GC-IMS技术的糙米风味信息指纹图谱数据库提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

一级粳型糙米(含水量14.3%)，由浙江恒天粮食股份有限公司提供(2016年12月收获于浙江杭州)。

1.2 仪器与设备

FlavourSpec 1H1-00053型顶空气相-离子迁移谱仪，德国G.A.S.公司；配备CTC CombiPAL顶空自动进样器，瑞士 CTC Analytics AG公司；CLOT 毛细管柱(15 m×0.25 mm×0.50 μm，德国CS-Chromatographie Service GmbH；氚电离源。

1.3 实验方法

1.3.1 储藏模式设计

粳型糙米以编织袋形式进行包装，每袋25 kg，袋装糙米按照层叠方式摆放，以聚氯乙烯薄膜槽管五面封密封方式储藏于杭州市粮食收储公司南星桥分公司的14 ℃恒温地下仓中。糙米样品按照包装方式不同分成A、B两组，A组通过充N2进行气调包装(N2浓度≥98 %)；B组为普通气体包装。储藏期为18个月，期间每隔0、6、12和18个月分别取样，分析储藏期内糙米风味物质变化过程。

样品编号依次为：A-0、B-0、A-6、B-6、A-12、B-12、A-18和B-18，每组样品取3个重复。

1.3.2 GC-IMS分析方法

顶空进样条件：称取3 g糙米，置于20 mL顶空样品瓶中，密闭封口后进行检测。顶空孵育温度60 ℃；采用振荡加热；孵育转速500 r/min；孵育时间15 min；顶空进样针温度85 ℃；进样量500 μL；清洗时间30 s。

GC 条件：色谱柱 FS-SE-54-CB-1(非极性，15 m × 0.53 mm × 0.5 μm)； 色谱柱温度 60 ℃; 运行时间 20 min; 载气(高纯N2，纯度≥99. 999%)；流速: 初始2.0 mL/min，保持2 min后在10 min 内线性增至15 mL/min，之后在20 min内线性增至100 mL/min。

IMS 条件：漂移管长度 5 cm；管内线性电压 400 V/cm；漂移管温度 45 ℃；漂移气为高纯N2(纯度≥99.999%)；流速 150 mL/min；IMS探测器温度 45 ℃。

1.4 数据分析与处理

采用GC×IMS Library Search V 2.2.1分析软件，利用内置NIST数据库和IMS数据库对样品中挥发性风味物质进行定性分析。结合Reporter插件、Gallery Plot插件、Dynamic PCA插件采用LAV(laboratory analytical viewer)对其建立标准曲线后进行定量分析，分别对数据进行多角度分析处理，获得二维、三维谱图，根据指纹图谱对比，直观且定量地比较储藏过程中糙米样品之间的挥发性有机物差异。采用MATLAB.R2017b对数据进行PCA分析和K均值聚类分析(K-means cluster)。

2 结果与分析

2.1 储藏期内糙米的GC-IMS谱图分析

图1为根据LAV分析得到的储藏过程中2种包装条件糙米的GC-IMS三维谱图。可以直观看出，8组糙米样品在储藏过程中挥发性有机物(volatile organic compounds，VOCs)的种类较为相似，组间差异性观察存在困难。为了更好地横向比较分析储藏时间和储藏条件对糙米风味物质的影响，通过采用差异对比模式，将谱图降维处理。图2为图1的二维俯视图，为了更加鲜明比较样品间的差异性，取样品A-0作为参比，其余7组样品依次扣减参比，扣减后背景色褪至白色。若糙米样品中VOCs含量高于参比，该物质显示红色；若糙米样品中VOCs含量低于参比，该物质显示蓝色。横坐标1.0处红色竖线为经归一化处理后的反应离子峰(reactive ion peak, RIP)。RIP 峰两侧的每一个点代表着一种挥发性有机物，点的颜色深浅直观反映出挥发性有机物浓度的高低变化，颜色越红，说明该种VOCs伴随储藏期含量上升，颜色越蓝，说明该VOCs在储藏过程中逐渐流失。

图1 不同储藏条件糙米的GC-IMS三维谱图比较

由图1可知，VOCs在离子迁移过程中，保留时间与漂移时间的二次方呈正比，即VOCs在迁移谱中保留时间越长，其对应的漂移时间相对越长。保留500～550 s时进行漂移的有机物，在A-6和B-6、A-12和B-12中颜色变化显著，说明保留至最后漂移出来的有机物受N2包装影响显著。保留300 s以内的有机物在图谱中逐渐由蓝色转变为黄色，说明该类有机物随糙米储藏时间的延长呈现下降趋势，其中绝大多数有机物在(200±50) s时已经完成了有效迁移。

图2 不同储藏条件糙米的GC-IMS俯视图差异对比

2.2 糙米挥发性有机成分定性分析

由图2可知，糙米在储藏过程中，VOCs的总体浓度呈下降趋势，但对于挥发性有机物的种类并不明确，因此进一步利用内置Gallery Plot插件在VOCs图库中选取所有离子峰进行指纹图谱对比。图3为选取的59种变化明显的部分特征离子峰的指纹对比图谱，横坐标是每种特征挥发性物质的编号，可以看出每组糙米样品的完整VOCs信息以及不同储藏时间和不同包装下糙米样品之间VOCs存在的差异，其中每一横行代表一次检测样品所选取的全部信号峰，每一列代表同一VOCs在不同糙米样品中的信号峰。

图3 不同储藏条件糙米GC-IMS谱图中VOCs图片库

将指纹图谱按储藏期划分成4个区域，虚线框内依次显示的是普通包装和N2气调包装下同期的2组糙米样品，每组样品进行3次平行实验，每六横行为同一储藏期。从每组虚框内VOCs离子特征峰排列中明显看出，普通包装和N2包装的差异不大，可能的原因是糙米在14 ℃低温储藏条件下，N2气调对其风味物质影响不大。相同储藏时间的糙米含有的挥发性成分，仅区别于包装条件，样品组内具有明显相似性，同一包装条件下不同储藏时间的糙米内特有的挥发性风味物质对应时间变化而变化，样品组间存有明显差异。根据对特征VOCs离子峰的保留指数、迁移时间数据、各样品中其峰体积数据和内标法计算的含量数据综合分析得出糙米样品相似度分析表(见表1)，组内相似度均高于95%，组间相似度则相对较低，其中普通包装糙米储藏18个月与对照组相比，其相似度仅有71%，说明储藏时间越久，糙米风味变化越大，香味物质流失越严重，组间相似度差异性越大。

表1 不同储藏条件糙米的相似度分析 单位：%

a-特征峰选取位置点；b-信号特征峰指纹图谱

根据图4-a中特征峰选取位置点分布情况，选出了反映糙米储藏过程中具有代表性的29种VOCs信号峰进行对比，分析结果见图4-b。根据特征峰特性，可以进一步解析出各峰所代表的风味物质，结果如表2所示。由于糙米胚中含有丙酮酸转氨酶，如图4虚框所示，2-乙基-1-己醇(异辛醇)和丙酮这2种物质在糙米储存到12个月时含量大幅降低，N2包装的含量均高于普通包装，对比其他VOCs含量变化趋势，普通包装和N2包装变化不显著，说明N2抑制了异辛醇和丙酮的减少，N2气调有效抑制了糙米胚中丙酮酸转氨酶活力的激活，对糙米生命活力有一定延缓作用。X框中的物质在糙米储存到6个月和12个月时含量下降，储存到18个月时，含量又有所上升，其中包括1-戊醇、2-戊基呋喃、辛醛、戊醛、反-2-辛烯醛、庚醇、庚醛、2-丁酮、1-辛烯-3-醇、反-2-庚烯醛和反-2-己烯-1-醇。推测造成这种变化趋势的原因可能与糙米储藏期间脂肪发生水解继而又通过游离脂肪酸氧化作用生成羰基化合物有关，其中主要的羰基化合物有醛类和酮类，故糙米储藏12～18个月时，2-丁酮、辛醛、戊醛、庚醛含量呈上升趋势。Z框中的物质在糙米储存到6个月时含量大幅降低，12～18个月内浓度不变或缓慢降低，随着储藏期延长，糙米中的香味成分逐渐流失，其中包括乙酸乙酯、乙酸丙酯、1-丙醇、戊醛、庚醛、壬醛、苯甲醛、乙酸丁酯和己醛等。Y框中的物质含量随储藏时间的延长逐渐增加，其中包括α-蒎烯、2-己酮、乙偶姻、2-甲基丙醇、2-庚酮、丁基甲酮、正丁醇、异丁醇、丙醇和乙酸丁酯等，其中乙偶姻是具有奶油香味的微生物发酵产物，结果表明，乙偶姻含量越高，受微生物污染影响越明显，根据指纹图谱可以快速评定储藏期间糙米受微生物污染轻重程度。

表2 部分特征峰对应的化合物

2.3 动态主成分分析

根据图4中不同糙米样品VOCs的种类排布及特征离子峰强弱可大致判断糙米的储藏时间，为了更便于主观观测认知，通过LAV内置Dynamic PCA插件以原有VOCs种类的高维数组为变量进行数据降维压缩，寻求对全部方差有影响力的2个方向，在不丢失主要信息的前提下，排除空间噪声和冗杂信息，避开变量间共线性问题，便于对不同储藏时间和包装方式的糙米进行特征差异可视化动态分析[24]。由图5可知，主成分1和主成分2的累计贡献率达87%(已包含原有变量绝大部分信息)，通过二维平面数据点图分布情况可直接观测到储藏时间和包装方式在糙米样品组内和组间的差异性，组内糙米样品在一定范围内分布较集中，相同储藏条件下的糙米样品重复性较好，同期2种包装方式的样品组间距离短，差异性不大，说明普通包装和 N2包装的糙米样品之间风味很相似。数据点大致分布成3簇，6个月和12个月位置较邻近作为一簇，均与0个月、18个月另2簇区域有明显间距，不同储藏时间的糙米样品特异性较明显，说明6个月和12个月的糙米样品风味比较相似，与初始糙米样品和储存18个月的糙米样品的风味差异较大。

2.4 K-means逐步聚类分析

将所抓取的糙米样品全部特征峰经过PCA降维处理后的数据，通过MATLAB欧氏距离编程公式，实现计算所有样本到聚类中心的距离并选出最小距离做类别划分[25]。糙米样品在进行K-means聚类分析时以储藏时间为变量，利用距离作为度量同种包装方式糙米个体之间关系紧密程度，检验其归类效果。其聚类算法运算原理为，根据组成每一类的观测量计算出各个变量均值，每一类中的n个均值在n维空间中形成第2次迭代类中心的y个点，继续依次迭代，直到达到指定迭代次数，迭代终止[26]。此次参与聚类分析的糙米样品的储藏时间为0、6、12及18个月，故簇数量K设置为4，中心轴线交点即为每个簇设置的初始质心。图6是为期18个月普通包装糙米和N2包装糙米VOCs降维数据K均值聚类分析结果，可以看出聚类效果尚佳，储藏6个月和12个月时2簇较接近，4簇分隔较清晰，簇间分布与特征峰走势相一致，由此可进行快速有效地根据聚类判别模型对糙米的藏储时间进行判断。

a-普通包装;b-N2包装

3 结论

本研究采用气相色谱偶联离子迁移谱技术，对大米储藏过程中挥发性有机物质进行检测，结合化学计量学和VOCs图谱库对糙米储藏时间和包装方式实现判别分析。根据挥发性物质组分特征、动态主成分分析和K均值聚类分析，初步建立了糙米行业风味GC-IMS指纹图谱。结果表明通过GC-IMS联用技术依据储藏过程中VOCs含量变化可以对糙米的储藏月份进行有效区分，不同储藏时间的糙米样品归类效果较良好。糙米在14 ℃低温储藏环境中，与普通包装相比，N2包装抑制了2-乙基-1-己醇、丙酮和异辛醇在储藏过程中的减少趋势，对其他风味物质则影响不大。根据设置的多个检测时间采点，获得了多组储藏期内糙米挥发性风味主成分信息，建立判别糙米储藏时间的数据库，可快速评定出糙米的储藏期，该GC-IMS联用技术为糙米风味研究提供了新的和理论依据和数据支持。