姜黄素通过激活SIRT1调节脓毒症小鼠模型的认知功能障碍研究*

曹 佳，杨华英，何 艺，程建红

四川省自贡市妇幼保健院儿科（自贡643010）

脓毒症是一种由宿主对感染反应失调引起的全身炎症。脓毒症及其并发症是ICU 患者的主要死亡原因，病死率高达30%～70%［1］。已经证明，脓毒症幸存者表现出长期的认知障碍，包括记忆力、注意力和整体认知功能丧失。而脓毒症继发的中枢神经系统功能障碍可发生在70%的脓毒症患者中［2］。脓毒症增加了神经退行性疾病和痴呆的风险，给医疗保健系统带来了巨大负担。因此，必须探索新药物来遏制患者的脓毒症。姜黄素（Curcumin，Cur）是从姜科植物姜黄中提取的一种酚类化合物，分子式为C21H20O6，分子质量368.39，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血脂、抗动脉粥样硬化等多种药理作用［3］。已有研究表明，姜黄素对脓毒症引起的大鼠急性肺损伤有保护作用［4］，但是其对脓毒症小鼠模型的认知功能障碍是否有影响尚不清楚。已有报道，姜黄素对创伤性脑损伤模型提供神经保护作用［5］，预测姜黄素对脓毒症小鼠模型的认知功能障碍具有改善作用。本文通过盲肠结扎穿刺（Cecal ligation and puncture，CLP）法制作脓毒症小鼠模型，探讨姜黄素对脓毒症小鼠模型的认知功能障碍的作用及机制。

材料和方法

1 材 料

1.1 动物：200 只3个月体重（25±3）g无特定病原体（Specific pathogen free，SPF）级的雄性美国癌症研究所（Institute of cancer researcch，ICR）小鼠，许可证号：SYXK（川）2017-203。实验动物饲养室温度控制在（21±2）℃、湿度控制在（55±2）%，光照／黑暗周期为12 h，自由进食和饮水。

1.2 试剂：姜黄素（HLPC≥99%），SIRT1 抑制剂EX-527，苏木素伊红（Hematoxylin eosin，HE）染色试剂、过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒、丙二醛（MDA）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒，RIPA 裂解缓冲液，BCA 试剂盒，IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 试剂盒，SIRT1、Ac-NF-κB，Ac-FOXO1和Acp53抗体。

1.3 仪器：Mu LTI-SKAN GO 型全自动酶标仪，FluorChem HD2 凝胶成像系统，视频跟踪系统XRXZ301，美国碧迪流式细胞仪FACS。

2 实验方法

2.1 模型构建及处理：先将120只小鼠随机分为假手术组、模型组、姜黄素低剂量组、姜黄素中剂量组、姜黄素高剂量组、地塞米松组，每组20只。再将80只小鼠随机分为模型组、姜黄素高剂量组、SIRT1 抑制剂组、高剂量+抑制剂组，每组20只。

盲肠结扎穿刺（Cecal ligation and puncture，CLP）诱导脓毒症［6］。通过腹膜内注射15 mg／kg氯胺酮和7.5 mg／kg甲苯噻嗪麻醉实验小鼠。用碘伏消毒后，在腹部中线进行2 cm 切口，露出盲肠。将粪便拖至盲肠用5／0丙烯线结扎并固定在回盲部连接杆下方，但不能引起肠梗阻。用18号针头将盲肠穿刺10次并稍微挤压直至出现一小滴粪便。将盲肠重新放于腹腔，缝合伤口。假手术动物接受了相同的剖腹手术，但没有盲肠穿刺，并作为对照组。手术后不久，所有动物皮下注射2 ml，0.9%氯化钠溶液。

在造模前12 h 及造模后2 h和12 h，姜黄素给药各组小鼠，分别腹腔注射50 mg／kg、100 mg／kg、200 mg／kg姜黄素（实验当天溶于质量体积分数为1%的二甲基亚砜）［7］；假手术和模型组小鼠注射等量二甲基亚砜；地塞米松组小鼠腹腔注射1 mg／kg 地塞米松［8］；SIRT1 抑 制 剂 组 小 鼠 腹 膜 内 注 射5 mg／kg，EX527［9］；高剂量+抑制剂组小鼠腹腔注射200 mg／kg姜黄素和5 mg／kg，EX527。每天检测小鼠存活情况，连续1周，进行生存分析。

2.2 旷场实验：将大鼠单独放置在长×宽×深（100 cm×100 cm×50 cm）的箱子中，使用视频跟踪系统XR-XZ301进行5 min内大鼠总行驶距离（m），站立次数，梳理毛发次数。在每个小鼠测试阶段后，均使用70%的酒精彻底清洁设备。

2.3 莫里斯水迷宫：Morris水迷宫装置由高60 cm、直径150 cm 的黑色圆形池组成，分为4个视觉象限，加（24±2）℃满水。将直径10 cm 的圆形平台放置在第三象限的中心，水面下方2 cm 处。连续4 d，将大鼠放入面向墙壁的池中，每只大鼠依次从4个象限进入，并以相同的顺序进入水里。在60 s内未能找到平台的大鼠被引导并允许在平台上停留10 s。将大鼠用于寻找平台的时间记录为潜伏期。在第5天，在没有平台的情况下，记录了在目标象限中花费的时间以及小鼠越过目标象限的次数。

2.4 HE 染色：麻醉后处死大鼠，分离出脑海马区组织，将脑海马区组织用4%多聚甲醛溶液固定后，常规脱水制成石蜡切片，然后脱蜡、苏木精液染色、1%盐酸酒精分化、0.6%氨水返蓝、0.5%伊红液染色，接着常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在200倍显微镜下观察神经细胞损伤情况。

2.5 流式细胞术：将海马区组织裂解并用4℃生理盐水迅速制成1∶9匀浆液，加入5 μl Annexin-V-FITC和5 μLPI，在黑暗的房间里孵化15 min，然后用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。细胞凋亡率=（早期凋亡细胞+晚期凋亡细胞）／全部细胞×100%。

2.6 Elisa实验：将海马区组织用4℃生理盐水迅速制成1∶9匀浆液，3 000 r／min 离心15 min，取上清液按照ELISA 试剂盒说明书操作检测IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。

2.7 氧化应激分析：根据所提供的试剂盒手册，海马组织中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）及抗氧化酶过氧化氢酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的活性来分析海马组织氧化应激情况。

2.8 蛋白印迹法：提取海马组织中总蛋白，采用BCA 蛋白检测试剂盒进行定量。将25μg蛋白质样品用12%SDS 凝胶电泳分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜，用5%牛血清白蛋白封闭过夜后，用兔抗大鼠单克隆抗体（SIRT1 1∶1000、Ac-NF-κB 1∶500，Ac-FOXO1 1∶1000和Ac-p53 1∶1000），4℃摇床上2 h，然后与山羊抗兔二抗（1∶2000）在4℃的摇床上摇1 h，ECL曝光，以β-actin为内参，使用Quantity One软件进行分析目标蛋白质的相对表达水平。

3 统计学方法 所有统计数据采用SPSS 21.0处理，图形使用Grap HPad Prism 6.0 构建的。实验数据以（¯x±s）表示，数据经shapiro-wilk检验发现均呈正态分布，多组进行One-Way ANOVA 分析发现方差齐，组间比较采用SNK 检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 姜黄素增强脓毒症小鼠生存 1周后，假手术组小鼠无死亡，模型组小鼠死亡7只，姜黄素低剂量组小鼠死亡4只，姜黄素中剂量组小鼠死亡3只，姜黄素高剂量组小鼠死亡1只，地塞米松组小鼠死亡2只。与模型组相比，姜黄素高剂量组和地塞米松组小鼠存活率明显升高（P＜0.05）（图1）。

图1 各组小鼠存活率

2 姜黄素改善脓毒症小鼠认知障碍 与假手术组相比，模型组小鼠总行驶距离、站立次数和梳理毛发次数及在目标象限时间和穿越区域的次数明显减少（P＜0.01），潜伏期时间明显增加（P＜0.01）；与模型组相比，姜黄素低剂量组无明显变化，姜黄素中、高剂量组和地塞米松组小鼠总行驶距离、站立次数和梳理毛发次数及在目标象限时间和穿越区域的次数明显增加（P＜0.05，P＜0.01），潜伏期时间明显减少（P＜0.05）（图2）。

图2 各组小鼠认知障碍情况

3 姜黄素改善脓毒症小鼠脑损伤 假手术组大鼠海马区神经细胞形态结构正常，排列整齐，细胞质饱满，细胞核清晰；模型组神经细胞体积变小，细胞核出现皱缩，存在严重的炎症因子浸润；与模型组相比，姜黄素中、高剂量组和地塞米松组大鼠神经细胞体积变小、细胞核皱缩和炎症因子浸润情况均有不同程度减轻。与假手术组相比，模型组小鼠神经细胞凋亡率明显增加（P＜0.01）；与模型组相比，姜黄素低剂量组无明显变化，姜黄素中、高剂量组和地塞米松组小鼠神经细胞凋亡率明显减少（P＜0.05）（图3）。

图3 各组小鼠脑损伤情况

4 姜黄素改善脓毒症小鼠炎症反应和氧化应激与假手术组相比，模型组小鼠海马组织中IL-6、TNF-α、IL-1β、MDA 含量均明显增加（P＜0.01），SOD 和CAT 活性明显降低（P＜0.01）；与模型组相比，姜黄素低剂量组无明显变化，姜黄素中、高剂量组和地塞米松组小鼠海马组织中IL-6、TNF-α、IL-1β、MDA 含量均明显减少（P＜0.05），SOD 和CAT 活性明显升高（P＜0.05）（图4）。

图4 各组小鼠炎症反应和氧化应激情况

5 姜黄素增加脓毒症小鼠脑组织中SIRT1的表达并降低了Ac-FOXO1、Ac-NF-κB和Ac-p53水平与假手术组相比，模型组小鼠海马组织中SIRT1表达明显下调（P＜0.01），Ac-FOXO1、Ac-NF-κB 和Acp53表达明显上调（P＜0.01）；与模型组相比，姜黄素低剂量组无明显变化，姜黄素中、高剂量组和地塞米松组海马组织中SIRT1 表达明显上调（P＜0.05），Ac-FOXO1、Ac-NF-κB和Ac-p53表达均明显下调（P＜0.05）（图5）。

图5 蛋白印迹法检测小鼠海马组织中SIRT1、Ac-FOXO1、Ac-NF-κB和Ac-p53表达

6 姜黄素通过激活SIRT1改善脓毒症小鼠模型的认知功能障碍 与模型组相比，SIRT1抑制剂组脓毒症小鼠存活率无明显变化，脓毒症小鼠总行驶距离、站立次数和梳理毛发次数及在目标象限时间和穿越区域的次数明显减少（P＜0.05），潜伏期时间明显增加（P＜0.05），神经细胞凋亡率明显增加（P＜0.05），海马组织中IL-6、TNF-α、IL-1β和MDA 含量均明显增加（P＜0.05），海马组织中SOD 和CAT 活性明显减少（P＜0.05），海马组织中SIRT1表达水平明显下调（P＜0.05），海马组织中Ac-FOXO1、Ac-NF-κB 和Ac-p53表达水平均明显上调（P＜0.05）；与姜黄素高剂量组相比，高剂量+抑制剂组脓毒症小鼠存活率无明显变化，脓毒症小鼠总行驶距离、站立次数和梳理毛发次数及在目标象限时间和穿越区域的次数明显减少（P＜0.01），潜伏期时间明显增加（P＜0.01），神经细胞凋亡率明显增加（P＜0.01），海马组织中IL-6、TNF-α、IL-1β、MDA 含量均明显增加（P＜0.01），海马组织中SOD 和CAT 活性明显减少（P＜0.01），海马组织中SIRT1表达水平明显下调（P＜0.01），海马组织中Ac-FOXO1、Ac-NF-κB和Ac-p53表达水平均明显上调（P＜0.01）（图6、7）。

图6 激活SIRT1改善脓毒症小鼠模型的认知障碍的影响

图7 激活SIRT1改善脓毒症小鼠模型的脑损伤、氧化应激和炎症的影响

讨 论

脓毒症是一种常见且可能致命的全身性疾病，常常导致不可控制的炎症、组织损伤和多器官功能衰竭，脓毒症及其并发症是ICU 患者的主要死亡原因［10］。同理，本研究发现，脓毒症小鼠生存率降低，而姜黄素能够增加脓毒症小鼠的生存率。认知障碍是脓毒症所致多器官功能障碍中的一种，严重影响脓毒症患者生存和预后。本实验用旷场实验反应小鼠活动和探索能力，Morris水迷宫试验反应学习和认知能力发现：脓毒症小鼠活动探索能力和学习认知能力均减弱，而姜黄素能够增加脓毒症小鼠活动探索能力和学习认知能力。初步说明姜黄素对脓毒症认知功能障碍具有改善作用。

过度的炎症、氧化应激以及严重的神经细胞凋亡被认为是脓毒症诱发的脑损伤和认知障碍的潜在机制［11］。海马在学习、记忆、情绪、内分泌及内脏活动中具有至关重要的作用。本研究可知，脓毒症小鼠神经细胞体积变小，细胞核出现皱缩，存在严重的炎症因子浸润，神经细胞凋亡率增加，这与Wang等［12］的研究相一致。同时本文发现姜黄素能够减弱这种病理改变。氧化应激和炎症离子都是触发神经细胞凋亡和坏死的最重要因素［13］。脓毒症中，氧化应激的发生和促炎性细胞因子和趋化因子（例如IL-6、IL-1β和TNF-α）的释放是神经元死亡的主要原因［14］。因此，减轻氧化应激和炎症应激是脓毒症认知障碍的重要治疗方法。姜黄素通过减轻大鼠氧化应激、炎症和细胞凋亡来减轻粘菌素诱导的肾毒性和神经毒性［15］。同样本文研究发现，姜黄素明显减少脓毒症小鼠海马组织中IL-6、TNF-α、IL-1 β、MDA 含量，升高SOD 和CAT活性，说明姜黄素能减弱脓毒症小鼠炎症反应和氧化应激反应。

沉默信息调节剂1（Silent information regulator 1，SIRT1）是重要的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性蛋白赖氨酸脱乙酰酶，可调节应激反应、炎症信号、细胞凋亡和细胞衰老［16］。SIRT1的活化抑制细胞凋亡，氧化和炎症离子，从而减轻脓毒症引起的多器官损伤，包括肺，肾和肝［17］。SIRT1的神经保护作用已在颅脑外伤，缺血性损伤和许多神经退行性疾病中得到证实［18］。本文发现，姜黄素能够上调SIRT1表达，说明姜黄素可能通过激活SIRT1来改善脓毒症小鼠认知功能障碍。SIRT1激活发挥抗凋亡、抗氧化和抗炎作用，与SIRT1介导下游信号蛋白（如FOXO1、p53和NF-κB）的脱乙酰作用密切相关。FOXO1被视为是一种代谢和抗氧化剂调节剂，可促进SOD 和CAT 的合成。SIRT1直接使FOXO1脱乙酰，从而刺激介导细胞保护作用基因的表达［19］。p53是具有强大促凋亡作用转录因子，是SIRT1的第一个非组蛋白脱乙酰基作用靶标，SIRT1对p53的脱乙酰作用与p53转录功能降低相关，从而抑制了凋亡。NF-κB 的激活通过增强包括IL-6、IL-1β和TNF-α在内的各种促炎性细胞因子的转录而参与败血症的发生和发展。SIRT1可以使NFκB脱乙酰化并抑制NF-κB 的活性，从而发挥神经保护作用［9］。本文研究可知，姜黄素下调脓毒症小鼠Ac-FOXO1、Ac-NF-κB 和Ac-p53 表 达。本 文 还 发现，加入一种非竞争性SIRT1抑制剂EX-527后，消除了姜黄素对脓毒症小鼠的作用，进一步证实了姜黄素通过激活SIRT1对脓毒症小鼠模型的认知功能障碍起调节作用。

综上所述，姜黄素通过激活SIRT1增强脓毒症小鼠存活率，增加脓毒症小鼠活动探索能力和学习认知能力，减少神经细胞凋亡率，减轻炎症反应和氧化应激反应，这与FOXO1、p53和NF-κB 的脱乙酰作用密切相关。这为脓毒症认知功能障碍的治疗提供参考数据，但其确切的机制仍需要进一步充分研究。