小檗碱联合人参皂苷Rb1对脂肪细胞炎症信号通路作用*

蔡之幸，陈 越

上海交通大学医学院附属同仁医院中医科（上海200336）

慢性低度炎症状态是代谢综合征（Metabolic syndrome，MS）存在的重要发病机制之一［1］。在肥胖的代谢综合征患者血清中，多种脂肪细胞炎症因子和血清炎症标志物如IL-6、TNF 等呈现明显地高表达状态。脂肪组织作为一个内分泌器官［2］已经成为学术界的共识。对抗脂肪组织的慢性炎性状态，有利于对胰岛素抵抗的调控，最终将预防代谢综合征患者的心脑血管等重要靶器官损伤事件的发生发展。

传统中药饮片中，具有清热燥湿作用的黄连和具有益气作用的人参是中医临床治疗2型糖尿病的常用药对。已有多方研究发现［3-4］黄连的主要有效成分小檗碱具有降低3T3-L1脂肪细胞TNF-α、IL-6等表达的作用，而人参的主要有效成分，人参皂苷［5］可通过多种分子机制发挥调节糖、脂代谢的作用。目前，该药对合用，对MS患者的干预，在分子生物学层面，是否有确切的增效作用，鲜有报道，人参的主要有效化学成分人参皂苷Rb1和黄连的主要有效成分小檗碱合用对脂肪细胞信号通路的作用并不十分清楚。本研究，主要从细胞生物学层面，观察两种主要有效成分的合用对改善脂肪细胞的慢性炎性状态下的胰岛素抵抗是否有增效作用。

材料和方法

1 材 料

1.1 实验药物与试剂：人参皂苷Rb1（简称Rb1）、小檗碱（简称Ber）、地塞米松（DXMS）、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤（IBMX）；重组人胰岛素（常规型，优泌林R）；牛血清白蛋白质（BSA）；胎牛血清（FCS）、高糖培养基（DMEM）；抗β-actin单克隆抗体，抗IKK-β单克隆抗体，抗IKK-α／IKK-β多克隆抗体，羊抗兔辣根过氧化物酶（HRP）连接的二抗；ECL 化学发光检测试剂盒、BCA 蛋白质检测试剂盒；3T3-L1前脂肪细胞株，购买于中国科学院上海细胞库。

1.2 主要仪器：通用电泳仪（E-1101）、伯乐半干转膜仪（125-0143）、BioPhotometer D30核酸蛋白质测定仪、高速离心机（E2720）。

2 实验方法

2.1 细胞培养与诱导分化：将3T3-L1前脂肪细胞生长至70%融合度，消化细胞种植于6 孔板中，用前体细胞培养液（90%DMEM+10%FCS）继续培养48 h。更换前体细胞培养液，继续培养48 h至细胞完全融合。待细胞完全融合后，更换为分化培养液（90%DMEM+10%FCS+IBMX+1.0μg／ml INS），继续培养48 h。48 h后，更换分化培养基为脂肪细胞维持培养基（90%DMEM+10%FCS+1.0μg／ml INS）。将细胞培养于脂肪细胞维持培养基中7-15 d，每2-3 d更换维持培养液1 次。诱导分化成熟3T3-L 脂肪细胞＞70%呈脂肪细胞表型，可用于实验（图1）。

图1 分化成熟的脂肪细胞

2.2 建立3T3-L1 脂肪细胞胰岛素抵抗模型：3T3-L1前脂肪细胞经诱导分化成熟为3T3-L1 脂肪细胞后，置于0.2%BSA 的DMEM 无血清培养液中，分别加入10μmol／L 小 檗 碱、10μmol／L 人 参 皂 甙Rb1、10μmol／L小檗碱加人参皂甙Rb1干预24 h，吸弃上清液后，收集经药物干预的各组脂肪细胞待用。

3T3-L1前脂肪细胞经诱导分化后，成为成熟的3T3-L1脂肪细胞，先置于0.2%BSA 的DMEM 无血清培养液，培养12 h后，换成含10μmol／L，TNF-α的0.2%BSA 的DMEM 无血清培养液，培养形成胰岛素抵抗状态，再培养12 h后，分别予10μmol／L 小檗碱、10μmol／L人参皂甙Rb1、10μmol／L 小檗碱+人参皂甙Rb1干预，12 h后，再次吸弃上清液，收集经药物处理的各组胰岛素抵抗模型脂肪细胞待用。

2.3 实时荧光定量法检测mRNA 的表达量：使用Trizol法抽提RNA，逆转录提取总m RNA，实时荧光定量法测定TNF-α、IL-6 的表达量。引物（TNF-α上游引物：ACGGCATCCATCTCAAAGAC 下游引物：CGGCAGAGAGGAGGTTGACT；IL-6 上 游 引物：AGTTGCCTTCTTTGGGACTGA 下 游 引 物：CAGAATTGCCATTGCACAAC），PCR 经DNA 变性、退火、延伸三步法后，测定其荧光信号表达，扩增至40个循环；根据熔解度曲线分析扩增后的特异性表达情况，持续检测其信号强度。

2.4 蛋白免疫印迹法（Western-blotting）检测IKK-β表达：于上述各组备用的脂肪细胞中，加入细胞裂解液，充分裂解各组脂肪细胞。于4℃下，离心机设置13000转／min，离心30 min 后，提取蛋白质，运用BCA 法，测定蛋白质浓度。在蛋白质样品中，加入上样缓冲液，经95℃蛋白变性5 min，分离转膜，室温下封闭2 h，使用一抗，4℃度环境下，孵育过夜，使用二抗室温环境下，蛋白质杂交2 h，经曝光、显影后，采用蛋白免疫印迹（Western-blotting）法检测IKK-β表达。

3 统计学方法 采用SPSS 15.0统计学软件，进行统计学分析。所有计数资料用均数±标准差（¯x±s）表示，符合方差齐性检验者，应用单因素方差分析进行各组组间比较，若差异显著者，应用LSD 法进行两两比较；不符合方差齐性检验者，若差异显著，则应用Tamhane's T2法进行两两比较。当P＜0.05时，认为两组之间差异存在统计学意义。

结 果

1 Ber、Rb1及Rb1+Ber干预对基础状态下的脂肪细胞炎症因子的作用 与空白对照组相比，Ber组脂肪细胞的TNF-α和IL-6的mRNA 表达量降低更明显（P＜0.01），Rb1组脂肪细胞的TNF-α和IL-6的mRNA表达量无明显变化，Rb1+Ber联合组的TNF-α和IL-6的mRNA 表达量亦无显著变化。见表1。

2 Ber+Rb1干预对胰岛素抵抗状态下的（TNFα刺激）脂肪细胞炎症因子的作用 与空白对照组比较，Ber组能显著地抑制TNF-α刺激下上调的TNFα、IL-6的表达（P＜0.01），而Rb1仅抑制TNF-α的表达（P＜0.01），Ber+Rb1两药合用，与Rb1单用作用类似，仅抑制了TNF-α的表达（P＜0.01）。见表2。

表1 Ber、Rb1及Rb1+Ber基础状态下脂肪细胞炎症因子表达比较

表1 Ber、Rb1及Rb1+Ber基础状态下脂肪细胞炎症因子表达比较

组 别 n TNF-αm RNA 相对值IL-6m RNA相对值空白组6 1.17±0.020 1.00±0.022 10μmol／L小檗碱组 6 0.75±0.026 0.80±0.024 10μmol／L人参皂甙组 6 1.17±0.019 1.00±0.020 10μmol／L小檗碱+人参皂甙组 6 1.19±0.015 1.02±0.018 F 值 - 83.04 81.08 P 值 - ＜0.001 ＜0.001

表2 Ber、Rb1及Rb1+Ber在TNF-α刺激下脂肪细胞炎症因子表达比较

表2 Ber、Rb1及Rb1+Ber在TNF-α刺激下脂肪细胞炎症因子表达比较

组 别 n TNF-αmRNA 相对值IL-6mRNA相对值空白组6 1.00±0.022 1.02±0.029 10μmol／L小檗碱组 6 0.78±0.024 0.88±0.020 10μmol／L人参皂甙组 6 0.81±0.019 1.84±0.020 10μmol／L小檗碱+人参皂甙组 6 0.82±0.016 1.88±0.018 F 值 - 69.47 92.08 P 值 - ＜0.001 ＜0.001

3 Ber、Rb1及Rb1+Ber对脂肪细胞主要炎症信号通路的影响 经TNF-α诱导后，加入Ber处理24 h的脂肪细胞，NF-κB 和IKK-β 表达水平下调，而RB1处 理 的 脂 肪 细 胞（无 论 是 否+Ber），NF-κB 和IKK-β表达水平上调。加入TNF-α诱导24 h 后，无论Ber、Rb1处理组或Ber+Rb1联合处理组，其磷酸化的IKK-β表达水平都呈上调趋势（图2）。

图2 小檗碱和人参皂苷Rb1合用对脂肪细胞主要炎症信号通路的影响

讨 论

代谢综合征（Metabolic syndromes，MS）是一类以中心性肥胖为核心，聚集了糖耐量异常、高血压、高血脂、高尿酸等多种心脑血管疾患危险因素的复杂代谢紊乱症候群［6］。胰岛素抵抗［7］，是MS公认的核心。目前认为，脂肪细胞的堆积［8］使得脂肪组织中的单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）及单核细胞转移抑制因子（MIF）被释放，导致脂肪组织直接被巨噬细胞浸润，在局部脂肪组织产生了大量的活性氧物质［9］，减少了抗氧化物质的产生。局部脂肪组织的氧化应激反应被激活，核转录因子κB（NF-κB）被激活，诸多脂肪因子，如肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、瘦素、脂联素的分泌异常，这些脂肪因子同时也是炎性因子，长期慢性释 放 入 血［10-11］，TNF-α 可 通 过 激 活 核 因 子-κB（NF-κB）抑制因子激酶（IKK），使κB 抑制因子（IKB）磷酸化而激活NF-κB，而NF-κB 又可促进TNF-α转录，从而形成低度炎症信号的正反馈环，导致或加重胰岛素抵抗。在长期慢性低度炎性反应刺激下，最终能导致MS的产生。

尽管MS 的诊断标准早已提出，MS 的心脑血管危害性也一再受到重视，现代医学对代谢综合征的治疗，近20年仍停留在针对某一症候的各组治疗，如单纯控制体重、控制血糖、控制血压、调脂固斑等，因代谢综合征患者存在心脑血管事件的高危风险，许多患者不得不选择上述药物的叠加给药，且终身给药。基于“整体观念”的中医药，在“代谢综合征”的管理上，具有独到优势。中医认为，黄连，苦寒之品，归心肝胃经，既能清热燥湿，又善清心胃之火。人参，性甘，微温，有大补元气，补脾益肺的功效，助运化，输精微，使气旺津生，以达到生津止渴的目的，能够针对MS患者肺脾之虚，补肺平喘又健脾调中，鼓舞脾气。黄连、人参相须为用，此药对主导的清热益气法对代谢综合征积极作用被许多学者认可［12］。

本实验中，我们利用现代细胞生物学技术，再次验证了Ber对脂肪细胞主要的炎性通路NF-κB 的下调作用。在临床实践中取得良好降糖疗效的人参，其主要成分人参皂苷Rb1，却能明显上调TNF-α诱导的脂肪细胞炎性通路NF-κB和IKK-β的表达水平，并且其磷酸化的IKK-β表达水平都呈上调趋势。当Ber联合Rb1时，这种上调趋势仍然没有改变。这与临床实践中观察到的黄连、人参药对有降低胰岛素抵抗的作用不符［13-14］。可见，人参的主要有效成分Rb1，并非从脂肪细胞炎性通路NF-κB的调节角度，实现其改善胰岛素抵抗的作用。最新研究发现，人参皂甙Rb1主要作用于PI3K／Akt信号通路，促进GLUT1、GLUT4蛋白表达和Akt磷酸化实现其胰岛素抵抗作用［15-16］，同时，人参皂苷Rb1及代谢物还可通过降低IRS1丝氨酸磷酸化、增加PI3K 活性、促使Akt活化来提高葡萄糖摄取；同时抑制炎性反应，达到改善IR 的目的。

NF-κB是机体的主要炎性通路之一。本研究未显示出人参皂甙Rb1对NF-κB通路的下调作用，恰恰相反，我们观察到人参皂甙Rb1有上调脂肪细胞炎性通路NF-κB 和IKK-β 的表达水平及上调磷酸化的IKK-β表达水平的趋势，这能否否认人参皂甙Rb1的降糖作用？能否可因人参皂甙Rb1无论是否联合小檗碱均有上调脂肪细胞炎性通路NF-κB 和IKK-β的表达水平及上调磷酸化的IKK-β表达水平的趋势，认为相互叠加的中药有效成分，有助增长脂肪细胞炎性反应，增加胰岛素抵抗的风险。

结合前述人参皂甙Rb1 在PI3K／Akt胰岛素信号传导上的研究［15-16］，我们认为中药的有效成分对脂肪细胞炎性反应及胰岛素抵抗的调控是多方面的；本研究中人参皂甙Rb1的胰岛素抵抗作用并不是通过对脂肪细胞NF-κB 通路的“抗炎”这条途径完成的。由此我们想到：中药的有效成分对单一信号通路的调节作用与临床所见的疗效可能不尽相同。同一中药的有效成分，可以作用于多条信号通路，发挥不同的调节作用［17］。中药有效成分对信号通路的影响，并非“1对1”的线性关系，也非“1+1”的增效关系，而是复杂的、相互作用的“非线性”关系。或许用“非线性”［18］方式来研究药物作用于靶标及信号通路中的困惑，可能为中药有效成分对疾病的积极作用研究提供途径。