益肾养髓方治疗脊髓损伤作用机制的网络药理学研究＊

齐保玉 ，孙 凯 ，2，银 河 ＊＊，朱立国 ，2＊＊，金哲峰，陈 忻，杨博文，陈 琳

（1. 中国中医科学院望京医院 北京 100102；2. 中医正骨技术北京市重点实验室 北京 100007）

脊髓损伤（Spinal cord injury，SCI）是由各种因素所导致的中枢神经系统损伤的疾病，分为原发性SCI和继发性SCI，以损伤平面及以下躯体运动、感觉功能障碍为主要临床表现，是目前困扰世界医学的难题之一，治疗难度大且具有损伤不可逆性的特点，是一种高致残率、高病死率的疾病[1,2]。以慢性脊髓损伤造成的脊髓型颈椎病（Cervical Spondylotic Myelopathy，CSM）为例，据统计，脊髓型颈椎病的发病率为41/106，患病率为605/106，其发生率逐年升高呈现年轻化趋势[3,4]。全球每年用于SCI 相关疾病治疗和康复的费用数以亿计，给社会和家庭带来了沉重的经济负担[5]。因此，开展脊髓损伤相关的机制及防治研究具有重要的现实意义。

目前，针对本病的治疗手段十分有限，西医主要采用手术减压、糖皮质激素和神经节苷脂药物治疗、高压氧治疗等[6,7]。中医药是我国独特的医疗资源，中医将本病归属于“血痹”、“骨痹”、“痿证”等范畴，药物治疗主要以活血化瘀、益精填髓为主[8]。本研究的“益肾养髓方”是在古代经典名方地黄饮子的基础上凝练而成，在治疗SCI方面具有一定的优势，尤其是用于治疗手术指征不明显的早中期CSM 患者已获得较满意的疗效，一项临床观察研究表明，益肾养髓方治疗总有效率达85.7%[9]。在另一项随机对照安慰剂的研究中，益肾养髓方治疗组的临床疗效显效率为80.77%，显著优于对照组，并且在一定程度上能够有效改善患者下肢运动功能和上肢感觉功能，进一步证实了其临床疗效[10]，但该方治疗SCI 疾病的作用机制尚未阐明。随着大数据时代的到来，建立在药理学、生物信息学、计算机技术等多学科理论基础上的网络药理学应运而生，其采用特定的算法对全球已构建的药物、疾病、基因等网络数据库进行虚拟筛选和综合分析，为预测药物作用于疾病的关键靶点和通路提供了可靠的研究平台[11,12]。网络药理学的提出和发展为中医药研究提供了强有力的理论依据和技术支撑，国内诸多学者在网络药理学研究方面做了大量的工作，有力的推动了中医药的传承与创新发展[13,14]。本文拟采用网络药理学的技术方法预测“益肾养髓方”治疗SCI相关疾病的关键靶点和可能作用机制，以期为该复方进一步研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 益肾养髓方活性成分及靶点筛选

通过中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP ，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[15]、中药综合数据库（Traditional Chinese Medicine Integrative Database ，TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid/）[16]搜集益肾养髓方药物的所有化学成分，药物组成：巴戟天、熟地黄、丹参、鬼箭羽等9味药组成，时间截止至2019 年 4 月 。 按 照 口 服 生 物 利 用 度（Oral bioavailability，OB）≥30%和类药性指数（Drug-like index，DL）≥0.18的参考值对所有化学成分进行筛选，并通过数据库检索获得的有效活性成分的潜在靶点。

1.2 SCI疾病相关靶点的收集

以“Spinal cord injury”为关键词检索，采用GeneCards（https://www.genecards.org/）[17]、TTD 数 据 库（https://db.idrblab.org/）[18]、OMIM 数 据 库（https://www.omim.org/）收集SCI 疾病相关的靶点。并通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）[19]对靶点进行转化。

1.3 益肾养髓方—SCI疾病靶点与PPI网络的构建

将获得的益肾养髓方药物靶点与SCI疾病靶点导入Cytoscape3.5.1 软件[20]，构建中药—成分—靶点—疾病的网络图。将药物与疾病共有的靶点蛋白通过STRING 11.0（https://string-db.org/）[21]在线数据库进行分析，构建蛋白互作网络（protein-protein interaction，PPI），设置相互作用阈值＞0.99，获取相应的数据供后续分析。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

将获得的关键靶点进行基因本体论（Gene Ontology，GO）功能富集分析（P＜ 0.05），阐释作用靶点的生物学功能。其次，将获得的关键靶点进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析（P＜ 0.05），阐明益肾养髓方治疗SCI 的相关信号通路。研究流程图见图1。

2 结果

2.1 益肾养髓方活性成分及靶点筛选

通过检索共获得益肾养髓方化学成分1071个，根据OB ≥ 30%，DL ≥ 0.18 阈值筛选，并删除重复后共获得益肾养髓方有效活性成分139 个（表1）。筛选获得有效活性成分的靶点共1597 个，删除重复后共获得217个药物靶点。

2.2 SCI疾病相关靶点的收集与中药—成分—靶点—疾病的网络图构建

通过 GeneCards、TTD 数据库、OMIM 数据库分别检索到SCI的相关靶点1518个、3个、7个，删除重复后共获得SCI 疾病相关靶点1524 个。随后通过Cytoscape3.5.1 软件构建中药—成分—靶点—疾病的网络图（图2）。并获得益肾养髓方药物治疗SCI 共有靶点118个。

2.3 益肾养髓方治疗SCI的PPI网络构建

将共同靶点通过STRING 11.0在线数据库（https://string-db.org/）构建PPI互作网络，将物种定义为人，设置最高置信度蛋白质参数评分值＞0.99，其他设置不变，获取相应的蛋白相互作用信息，获得关键靶点蛋白 107 个（图 3）。根据 Count 值列举前 30 的关键靶点（图4）。

图1 益肾养髓方治疗SCI的网络药理学研究流程图

表1 益肾养髓方主要有效活性成分

续表

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图2 中药—成分—靶点—疾病的网络图

图3 益肾养髓方治疗SCI疾病PPI网络

图4 益肾养髓方治疗SCI疾病PPI网络关键靶点（排名前30）

2.4 关键靶点的GO功能富集分析

利用Cytoscape 软件功能对118 个关键靶点的功能进行富集分析，确定了158 个GO 条目，主要涉及到细胞因子受体结合、磷酸酶结合、跨膜受体蛋白激酶活性、生长因子结合等各方面，GO 功能富集分析排名靠前的条目主要是细胞因子受体结合（GO:0005126 cytokine receptor binding）、转录因子活性，RNA 聚合酶II 近端启动子序列特异性DNA 结合（GO:0000982 transcription factor activity, RNA polymerase II proximal promoter sequence-specific DNA binding）、受体配体活性（GO:0048018 receptor ligand activity）、转录激活因子活性，RNA聚合酶II转录调控区序列特异性DNA结合（GO: 0001228 transcriptional activator activity, RNA polymerase II transcription regulatory region sequencespecific DNA binding）、细胞因子活性（GO:0005125 cytokine activity）等，列举了前20个条目（表2，图5）。

2.5 关键靶点的KEGG通路富集分析

在KEGG 通路富集分析中，确定了142 条信号传导通路，涉及到细胞炎症、凋亡、衰老等通路，通路富集分析的条目主要是糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（hsa04933 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、PI3K-Akt 信号通路（hsa04151 PI3K-Akt signaling pathway）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（hsa05167 Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、人巨细胞病毒感染（hsa05163 Human cytomegalovirus infection）、IL-17 信号通路（hsa04657 IL-17 signaling pathway）等，列举了前20 个条目（表3、图6）。

3 讨论

脊髓损伤是脊柱相关最严重的疾病或并发症之一，其治疗一直是国内外学者研究的重点与难点。中医认为，脊髓损伤主要由坠堕打仆等外因和筋脉失养等内因造成，与督脉、任脉、冲脉密切相联，病因病机十分复杂，治疗原则视脊髓损伤不同的阶段和表现而定，急性早期损伤以实为主，宜活血行气、化瘀通络，慢性长期损伤以虚为主，宜养血补气，填精生髓[22,23]。《灵枢经·寒热病论》中记载：“身有所伤，血出多，及中风寒。若有所堕坠，四肢懈惰不收，名曰体惰。”这与现代医学对于脊髓损伤的认识大同小异。谭明生教授[24]提出了“病证结合，从督论治”脊髓损伤的思路，王明新[25]等认为急性期脊髓损伤药物治疗必须以“祛瘀通督”为指导。实践表明在中医经理论指导下的方药，如补阳还五汤[26]、益肾养髓方[9,10]等均可以有效改善轻、中度脊髓压迫和损伤的患者的症状，临床疗效确切，但其内在分子机制却尚未明确。

本研究搜集中药化学成分主要基于TCMSP 数据库[15]及华东师范大学研发的TCMID 数据库[16]，其中TCMSP 数据库是西北农林科技大学王永华教授团队研发的，包括中国药典注册的499种中药，含29,384种成分，3,311 个靶标和837 个相关疾病，是目前中药网络药理学研究较为全面和公认的数据库。从网络药理学的角度证实，益肾养髓方中9 味药物存在1 个药物作用于多个靶点与1 个靶点对应多个药物的情况，是多靶点、多途径共同发挥效应的。方中betasitosterol、isoprincepin、sclareol 等活性成分涉及到抗炎、止痛、调节免疫、消肿、抗氧化、抗细胞调亡、利尿等现代药理作用[27,28]，生物学功能与转录因子活性、细胞因子受体结合、磷酸酶结合、跨膜受体蛋白激酶活性等密切相关。研究表明，方中有效成分黄芪多糖能延缓SCI后的病理进程，改善大鼠BBB评分，促进脊髓功能修复[29]。方中有效成分丹参酮IIA 磺酸钠可能通过炎症相关途径，抑制NF-κB 的活性，降低CX3CR1、TNF-αmRNA 的表达水平，从而减轻大鼠神经病理性痛[30]。根据PPI 蛋白互作网络的结果得出，益肾养髓方治疗 SCI 疾病最相关的基因有：STAT3（40）、AKT1（31）、JUN（30）、MAPK1（30）、IL6（26）、RELA（24）等，STAT3 是信号传导与转录激活因子蛋白家族中的重要成员，Herrmann JE[31]等研究表明 STAT3 是 SCI 后星形胶质细胞增生和瘢痕形成的关键调节因子。STAT3和SOCS3在SCI后的NG2细胞增殖和分化中发挥重要的调控作用[32]，而丹参酮IIA 能够作用于此信号通路[33]。AKT1是SCI后修复的重要靶点。研究发现，通过激活Akt/ mTOR，减少自噬，能够起到对神经元的保护作用[34]。刘杨[35,36]等研究证实激活PI3K/Akt/mTOR信号途径，有助于SCI早期神经功能的修复，丹参注射液能够显著提高PI3K、Akt 及mTOR 的转录水平促进SCI 功能修复，而 Chen 等认为抑制 PI3K/Akt/mTOR 通路有利于减轻SCI 后胶质瘢痕的形成[37]。在本研究KEGG 通路富集分析中显示，PI3K/Akt 信号通路是预测作用的重要信号通路之一，但益肾养髓方治疗SCI作用机制是否与调控Akt 靶蛋白表达及其磷酸化水平，影响Akt/mTOR 信号通路及调节细胞自噬水平有关，这可以作为今后研究探讨的重要方向之一（图7）。

表2 益肾养髓方治疗SCI的GO功能富集分析

图5 关键靶点GO功能富集分析情况（排名前20）

表3 益肾养髓方治疗SCI关键靶点KEGG分析

图6 关键靶点KEGG通路富集分析（排名前20）

图7 PI3K/Akt/mTOR通路

随着技术的飞速发展，越来越多的研究发现，在转录组水平上，microRNA 已成为SCI 后复杂的病理生理过程中重要的参与者和调控者，如miRNA-21等，在炎症反应、细胞增殖和凋亡和神经再生与修复等方面发挥重要作用[38,39]。如何将有效复方作用机制或中药单体与SCI 前沿热点研究相结合，是值得我们深入思考的问题。网络药理学已广泛应用于中药复方及其配伍的研究，其可以有效预测中药复方中的作用靶点及网络，有利于复方的更深入研究和发现新适应症[40]。本文主要从网络药理学的角度初步探讨了益肾养髓方治疗脊髓损伤的作用机制，初步揭示了其关键靶点、生物学途径及相关的信号通路。尽管网络药理学的整体性、系统性的特点与中医药整体观、辨证论治、组方配伍的原则不谋而合[41]。但单纯的成分—靶点—通路的分析未必能全面反应中药协同配伍调节的作用，且研究尚未对网络药理学筛选出的关键靶点和通路进行实验的验证，这也是本文存在的局限性。课题组前期通过初步实验研究表明益肾养髓方具有促进受损脊髓组织内神经细胞的修复作用[10]。今后将基于网络药理学提供的信息，进一步通过细胞和动物水平对关键的靶点和通路进行验证，为益肾养髓方治疗CSM提供更加充分的依据。