基于表观遗传学探讨针灸缓解内脏高敏感的可能机制＊

郭 静，裴丽霞，宋亚芳，孙建华

（南京中医药大学附属医院 南京 210029）

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一种以腹痛及排便习惯改变为主要临床表现的功能性肠病[1]。内脏高敏感是IBS重要的发病机制，主要表现为内脏痛觉过敏、感觉异常，在接受扩张刺激时，结直肠的容积和压力阈值均明显降低[2]。内脏高敏感的机制尚不清楚，可能与结肠伤害性刺激输入、肠道通透性增加、肠神经内分泌活动改变等有关[3,4]。近年来，日趋增多的证据表明，表观遗传修饰在慢性内脏疼痛的致敏和发展中发挥重要作用[5,6]。临床研究表明针灸治疗IBS 安全有效[7]，动物实验显示针灸可以缓解IBS 内脏高敏感[8,9]。针灸缓解内脏高敏感的机制复杂，表观遗传修饰可能参与其中。

1 表观遗传学的定义与基本内容

表观遗传学是指由发育或环境因素引起的，在没有DNA 序列改变的情况下，基因功能发生稳定的、可遗传的改变。其基本内容包括：DNA 甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控、染色质重塑等[10-14]。DNA甲基化是指在DNA 甲基化转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化作用下，将甲基基团与DNA 的CpG 二核苷酸的胞嘧啶核苷共价结合，从而调控基因的表达[15]。组蛋白修饰包括甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化、糖基化等，通过影响组蛋白与DNA 的亲和性从而改变染色质的结构[16]。组蛋白修饰不仅可以直接调节转录，还可以影响DNA的修复与复制、细胞分裂、细胞周期等[12]。非编码RNA 包括长链非编码RNA 和短链非编码RNA，参与转录调控及转录后基因调控[17,18]。同时，非编码RNA 能够参与DNA 甲基化、组蛋白修饰等环节，引起基因的沉默或上调[13]。

2 表观遗传学与内脏高敏感

2.1 DNA甲基化与内脏高敏感

中枢致敏是IBS 患者内脏高敏感重要原因之一，应激引起的下丘脑- 垂体- 肾上腺皮质轴（hypothalamic-pituitary adrenal，HPA）激活在其中扮演重要角色[5]。近年来一些研究显示DNA甲基化参与调节应激诱发的内脏高敏感。反复避水应激（water avoidance stress，WAS）可以引起啮齿类动物内脏疼痛，是常用的IBS 内脏高敏感的模型[19,20]。一项研究结果表明，WAS 应激大鼠表现出内脏敏感性增加，杏仁核中糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）基因的甲基化增加而促肾上腺皮质激素释放因子（corticotropin releasing factor，CRF）启动子的甲基化减少，伴随着GR mRNA 的表达减少而CRF mRNA 表达增加。而在脑室中注入组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂曲古抑菌素A 可显著缓解WAS 引起的内脏超敏反应[21]。早期生活应激的母婴分离模型同样可以使HPA 轴活化，CRF 的表达增加[5]。在另一项研究表明，母婴分离引起的HPA 轴活化与CRF 启动子低甲基化有关，并增强了成年后CRF 对应激的转录反应[22]。针灸可以减少腹泻型肠易激综合征（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D）患者及模型大鼠血清及下丘脑中CRF 的表达，减轻内脏高敏感症状[23,24]。目前，针灸调控CRF 的上游机制尚未阐明，针灸是否可以通过降低CRF启动子DNA甲基化水平，调节HPA 轴从而缓解内脏高敏感有待进一步证明。

此外，表观遗传在应激诱导的内脏超敏反应外周机制中同样发挥作用。WAS 大鼠L6-S2 背根神经节（dorsal root ganglia，DRG）中糖皮质激素受体基因（nuclear receptor subfamily 3, group C, member 1；NR3C1）启动子的甲基化增加，下调了NR3C1 的转录和表达。DNMT1 相关的大麻素1 型受体基因（cannabinoid receptor 1 gene，CNR1）启动子甲基化上调，同时由NR3C1 介导的CNR1 表达下调。敲低大鼠L6-S2 DRG 神经元中的DNMT1 可以减少CNR1 启动子甲基化，并降低慢性应激引起的内脏痛[25]。内源性大麻素受体广泛分布于痛觉的传导通路中，同时参与了针刺诱导的镇痛作用[26,27]。针刺发挥减轻内脏高敏感是否通过调节CNR1 启动子的甲基化水平有待考证。

针灸调控DNA 甲基化缓解IBS 内脏高敏感尚处于空白阶段，但我们可以从针灸在其他疾病关于DNA甲基化机制的探索中找寻依据。电针大肠俞募穴干预慢性传输型便秘大鼠后发现，结肠组织中胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）启动子区的 CpG 水平增加，甲基化水平降低，影响了GDNF 的基因转录水平[28]。研究发现，IBS 结肠和脊髓组织中GDNF 高表达，艾灸可以降低GDNF 及 GDNF 家族受体α3 的表达[29]。艾灸是否通过调节GDNF 启动子区的甲基化水平，影响GDNF 的表达，从而发挥对IBS 的治疗效应，还有待进一步探索。在一项电针干预多囊卵巢综合征模型大鼠的研究中，电针降低了下丘脑中整体DNA 甲基化水平和DNMT3b 的表达。焦磷酸测序表明，电针干预后Camk2b 和 Ar 的 DNA 甲基化水平降低[30]。艾灸“足三里”穴位局部可以引起低甲基化改变，主要发生在内含子区[31]。“足三里”是治疗IBS 内脏高敏感常用选穴，我们猜测针灸可能是通过引起某些靶基因低甲基化改变从而缓解内脏高敏感。

2.2 组蛋白修饰与内脏高敏感

环境或慢性应激对表观基因组的重塑可能导致基因表达的长期变化。现有研究表明，组蛋白去乙酰化可能加重内脏疼痛，而HDAC 抑制剂可以通过增加组蛋白乙酰化水平来减轻内脏高敏感。中央杏仁核（central amygdala，CeA）中的表观遗传程序，特别是组蛋白修饰，在维持慢性焦虑和疼痛中非常重要。CeA长时间暴露于升高的皮质类固醇（corticosteroids，CORT），通过激活GRs 和CRF 促进长期焦虑和内脏疼痛[32]。一项研究利用染色质免疫沉淀实验证实CeA 中GR 表达的降低是由于GR 启动子处组蛋白3 赖氨酸9乙酰化（histone 3 lysine 9 acetylation，H3K9Ac）的减少所导致的。此外，H3K9Ac 的减少可能是由于组蛋白去乙酰基酶Sirtuin-6的活性增加引起的。Sirtuin-6可以通过CORT 诱导的NF-κB 信号转导募集到GR 启动子区域。在CeA 内注射HDAC 抑制剂可以通过恢复GR 启动子上H3K9Ac 来防止GR 表达的下降，从而逆转CORT诱导的内脏高敏感[33]。

组蛋白修饰在内脏高敏感外周机制中作用的现有研究主要集中在组蛋白乙酰化/去乙酰化对相关受体的调节。瞬时受体电位辣椒素受体1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）是 IBS 内脏高敏感重要的外周机制之一。慢性应激会增加L6-S2 DRG 神经元中TRPV1 启动子处的组蛋白乙酰基转移酶EP300 的表达，增加TRPV1 启动子的组蛋白乙酰化，从而导致TRPV1的表达的增加，形成内脏高敏感。敲低大鼠DRG 神经元中的EP300 减少了TRPV1 启动子的组蛋白H3 乙酰化，并预防了应激大鼠的内脏痛觉过敏[25]。谷氨酸是迷走神经回路中重要的神经递质，代谢型谷氨酸受体（metabotropic glutamate receptor，mGluR）与内脏高敏感密切相关[34]。在慢性应激的大鼠模型中，HDAC 抑制剂可以增强脊髓中H3K9Ac、雌激素受体α与代谢型谷氨酸受体2 型基因（metabotropic glutamate receptor type 2 gene，GRM2）启动子相同区域的结合，减轻雌激素引起的内脏高敏感[35]。该团队后来进一步研究显示HDAC 抑制剂增加了脊髓中 H3K9Ac、H3K18Ac 与 GRM2、GRM3 启动子上的几个位点的结合，上调了mGluR2 和mGluR3 的表达，并减轻了应激引起的内脏超敏反应[36]。

目前尚无针灸通过改变组蛋白修饰缓解内脏高敏感的研究，但是朱冰梅老师团队首次揭示的针刺保护缺血性心肌病的表观遗传调控机制为我们提供了很好的思路。研究表明针刺能明显增加血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）启动子上H3K9Ac，从而证实针刺可通过调控组蛋白H3K9Ac 水平，促进VEGF 转录表达，介导缺血心肌血管新生，实现心肌保护效应[37]。新近研究显示，针刺百会、印堂穴可以通过下调慢性应激模型大鼠海马HDAC2 蛋白表达，促进海马组蛋白H3K3 乙酰化，增加脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）表达，缓解大鼠的抑郁样行为[38]。BDNF同时又与IBS 内脏高敏感相关，前期临床研究显示针刺可以降低IBS-D 患者血清BDNF 水平[39]，进一步可以探究针刺是否通过调控组蛋白修饰改变BDNF的表达，从而发挥缓解内脏高敏感的效应。

2.3 非编码RNA与内脏高敏感

2008 年 microRNA（miRNA）开始出现在 IBS 机制研究中。研究显示miRNA-510 和血清素受体3E 基因共定位在IBS-D 患者的肠上皮细胞中，表明特有的miRNA 存在于 5-HT 信号转导的 IBS 患者中[40]。5-HT信号传递系统与肠道感觉密切相关，在IBS 发病中发挥重要作用。随后多个研究报道了miRNA-24、miRNA-16、miRNA-103 和 miRNA-200a 对 5-HT 信号系统的调节作用。IBS 患者和小鼠结肠粘膜上皮细胞中miRNA-24 表达增加。5-HT 转运体（serotonin transporter，SERT）是miR-24 的潜在靶基因。miRNA-24抑制剂可以增加IBS小鼠近端结肠的疼痛阈值和伤害性阈值水平，降低过氧化物酶活性，并上调肠粘膜上皮细胞SERT 的mRNA 和蛋白表达水平[41]。另一项研究表明，IBS-D 患者空肠中miRNA-16 和miRNA-103 表达水平降低可能导致5-HT4 受体活性升高，进而引起肠道分泌和蠕动增加[42]。在IBS-D 大鼠模型中发现上调的miRNA-200a 可以通过下调CNR1 和SERT加重IBS内脏高敏感[43]。

据报道，IBS-D 患者血液微囊泡、小肠和结肠组织中均存在miRNA-29a 表达增加。miRNA-29a 的互补序列与谷氨酰胺合成酶（glutamate-ammonia ligase，GLUL）基因的 3'-UTR 结合，减少了 GLUL 的合成，从而增加肠道黏膜通透性[44]。该团队进一步在IBS 患者和miRNA 基因敲除（Mir29-/-）小鼠模型中验证miRNA-29 家族对肠道通透性的影响，研究表明miRNA-29a/b 可以通过降低闭合蛋白-1（claudin 1）和NF-κB 抑制因子的表达，增加肠道通透性[45]。在IBSD 大鼠模型中miRNA-29a 的作用机制也得到了证实，上调的miRNA-29a 可以降低水通道蛋白1（aquaporin 1，AQP1）、AQP3、AQP8 的表达，增加肠道通透性[46]。此外，一项新近研究进一步探索了miRNA-29a 介导5-HT 信号系统在内脏高敏感的机制作用，5-HT7 受体是miRNA-29a的直接靶标，miRNA-29a敲除可以导致5-HT7受体的过表达和内脏痛觉过敏的减弱[47]。

IBS 患者血液中循环miRNA-150 和miRNA-342-3p表达水平升高。值得注意的是，miRNA-150与肠道炎症及疼痛密切相关，而miRNA-342-3p 则可以通过电压门控性L型钙离子通道α1C蛋白来进行疼痛信号转导，降低结直肠痛阈，从而增加内脏敏感性[48]。本团队前期通过筛选IBS-D 患者与健康志愿者血清miRNA 差异表达谱系，发现IBS-D 患者血清中miRNA-1305、miRNA-575、miRNA-149-5p、miRNA-190a-5p、miRNA-135a-5p、miRNA-148a-3p 表 达 上调，miRNA-194-5p、miRNA-127-5p 表达下调。针刺可以下调IBS-D患者血清miRNA-148a-3p的表达。

IBS-D 患者结肠组织中miRNA-199 表达明显下降。miRNA-199 的表达水平与VAS 评分及胃肠道症状呈负相关。通过荧光素酶报告检测，从分子机制水平证实了miRNA-199 是TRPV1 关键的调控因子，miRNA-199 在细胞内可以通过抑制TRPV1-mRNA 的转录的方式下调TRPV1 的表达。IBS-D 患者miRNA-199 缺乏直接造成TRPV1 表达增加，导致了IBS 患者的慢性内脏疼痛[49]。本团队尚未发表的研究结果表明，IBS-D 患者与健康志愿者相比结肠组织中miRNA-199 的表达下降，TRPV1 表达升高。经过12周的针刺治疗，患者腹痛等不适症状得到有效缓解。针刺可能是通过上调miR-199，减少TRPV1 的表达发挥效应。

3 基于表观遗传学对内脏高敏感的治疗

表观遗传标记由表观遗传修饰酶催化和维持，一般来说是可以长期持续的，但在某些条件下可以被修改甚至逆转。表观遗传标记的可逆性和表观遗传修饰酶的抑制剂为内脏高敏感的表观遗传相关治疗的发展提供了潜力。上文中提及的一些临床前研究提示，HDAC 抑制剂可能是缓解IBS 相关的内脏高敏感的潜在方法。HDAC 抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）可以逆转早期应激引起的内脏高敏感反应和结肠动力增加[50]。在中枢CeA 内注射HDAC 抑制剂可以通过增加GR启动子上H3K9Ac，恢复GR表达水平，从而逆转CORT 诱导的内脏高敏感[33]。在脊髓水平，HDAC 抑 制 剂 增 加 了 脊 髓 中 H3K9Ac、H3K18Ac 与GRM2、GRM3 启动子上的几个位点的结合，上调了mGluR2 和mGluR3 的表达，从而减轻内脏高敏感[36]。目前被批准用于临床的HDAC 抑制剂包括罗米地辛、伏立诺他、贝利司他、西达本胺，主要用于恶性肿瘤的治疗，尚无用于缓解IBS 内脏高敏感的HDAC 抑制剂药物。DNA 甲基化、组蛋白乙酰化、miRNA 等过程参与IBS 内脏高敏感形成。针灸可以缓解内脏高敏感，尽管基于表观遗传学探讨针灸相关机制的研究仍为空白，但是前辈们关于针刺调控表观遗传学的相关结论以及本团队围绕miRNA 展开的两项探索性实验，为未来该领域的研究提供了思路。

4 结语

综上，表观遗传调控在IBS 内脏高敏感的发病机制中发挥重要作用。IBS 是一种环境因素和遗传因素共同作用的疾病，环境和应激可以导致表观遗传标记的持续性改变。在研究IBS内脏高敏感机制时引入表观遗传调控，可以为我们提供更全面的视角。DNA 甲基化、组蛋白修饰、miRNA 调控可以导致离子通道或受体表达的长期变化，改变神经元的兴奋性，促进慢性内脏疼痛的发生。表观遗传修饰在某种程度上是可逆的，DNMT 抑制剂、HDAC 抑制剂可以逆转内脏高敏感，目前这些药物尚停留在临床前实验阶段。针灸可以有效缓解IBS 内脏高敏感，一些前期的探索性研究提示表观遗传调控机制可能参与其中。然而表观遗传调控机制在该领域的研究尚处于空白状态，我们有理由相信表观遗传学可以为针灸治疗IBS内脏高敏感的机制探索提供较好的研究方向。