外泌体源性miRNA在卒中及卒中后抑郁中的治疗作用及研究进展＊

林亮吟，李小黎，刘海鹏，陈弘婧，刁华琼，丁海月，魏 丹

（北京中医药大学第三附属医院 北京 100029）

1 外泌体和外泌体源性miRNAs(microRNAs)

1.1 外泌体

外泌体是指细胞内的多囊泡体与细胞质膜融合后主动分泌到细胞外的一种小囊泡。外泌体直径约为40-100 nm，呈均匀球形，存在于大多数生物液中，是细胞外最小的囊泡[1]。

外泌体由神经系统中几乎所有细胞类型组成或依赖刺激释放，包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞[2-3]。外泌体中存有各种核酸类物质，包括 mRNAs、miRNAs 和 ncRNAs。当外泌体在细胞间循环运输时，这些外泌体RNA 可以被邻近细胞或远处细胞吸收利用，进而调节受体细胞。并且，外泌体能够通过血脑屏障，将其内包含的物质信息传递到大脑中，这对外泌体源性miRNAs 治疗神经精神疾病提供有力的基础。

1.2 外泌体源性miRNAs

外泌体源性miRNAs 是一种存在于外泌体中，约17-24 个核苷酸（Nucleotide，nt）大小，非编码的RNA。miRNAs 可以稳定地存在于唾液、尿液、母乳、血液等多种体液中[4-6]，这些miRNAs通过与受体细胞作用，参与许多生物学活动，影响疾病的发生和发展。每个miRNA可以调控数百种不同的mRNAs，这表明约有一半的人类转录组受miRNAs 调控[7]，为miRNAs 调节人类基因表达提供有力的依据。

2 外泌体源性miRNA与脑卒中

2.1 脑卒中

2.1.1 脑卒中

脑卒中发病年龄大约在55-64岁之间。其中缺血性脑卒中占主体，约为87%左右[8]，随着人类寿命的延长和人口老龄化的加快，我国发生缺血性脑卒中的比例越来越高，造成的危害日趋严重。脑卒中的治疗主要以预防为主，找到更有效的治疗方式成为现代脑血管病研究的重要方向。目前发现卒中与一氧化氮合酶基因、炎症反应相关因子基因相关。最新研究表明，多个miRNAs 在脑卒中发生后表达水平均有改变[9]，提示外泌体源性miRNAs 可能在脑卒中的发生发展中扮演着重要的角色。

2.1.2 外泌体源性miRNAs与缺血性脑卒中

缺血性脑卒中和其他类型的缺氧缺血再灌注损伤后的miRNA 表达在区域和时间上存在差异，利用这些差异对比，可以用于了解各样miRNAs 水平的改变与卒中后不同阶段的神经、血管系统的修复关系。现已发现存在特定的miRNA 与卒中发病有关，如HsamiR-133a在卒中的病理生理学中起作用，它参与血管平滑肌细胞分化的调节，这可能与颈动脉斑块有关[10]；miR-let-7 调控单核细胞TLR 信号通路，与神经树突状细胞分化相关[11]；miR-133b 可被转移到邻近的星形胶质细胞和神经元中调节基因的表达，有利于卒中后神经突的重建和功能恢复[12]；研究表明，缺血性脑卒中组血清miR-29 水平显著降低，对缺血性脑卒中具有潜在的鉴别诊断价值[13]。通过研究外泌体源性miRNAs 与卒中发生发展的关系，对未来治疗卒中提供新的方向。

（1）参与神经元重塑

首先，外泌体源性miRNAs 参与退化神经突的清除。当在缺血或缺氧环境下，诱导小胶质细胞miR-181c表达下调时，miR-181c可通过调控Toll-样受体4（Toll-like receptors 4，TLR4）及其下游核因子激活的B细胞κ-轻链增强蛋白质复合物（Nuclear factor-kgene binding，NF-kB）及炎性因子通路，使小胶质细胞去除退化的神经突，来调控神经元损伤[14]。有研究发现，miR-338 可以抑制负性调控神经元生长基因mRNAs的翻译，当小胶质细胞与来自受刺激的神经母细胞瘤外泌体miR-338 预孵育时，神经突的清除速度加快，表明神经外泌体通过小胶质细胞的活化，起到清除神经突的作用，此作用有利于重组大脑中复杂的神经回路[15]。

其次，外泌体源性miRNAs 也参与调节神经细胞的生长。如miR-152 在中枢神经系统中表达，且自胚胎早期至出生后表达水平基本呈上升趋势[16]。miR-21对缺氧缺血损伤的神经细胞有保护作用[17]。

最新研究表明，miR-9 和miR-124 可能是脑卒中后诱导神经发生的核心调控因子。miR-9、miR-124、核受体TLX、B 淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，BCL2）和组蛋白脱乙酰酶4基因（Histone deacetylase 4，HDAC4）之间相互作用，构成了脑缺血后神经再生的正反馈环路，从而参与神经重塑[18]。实验表明，在众多miRNAs 中，miR-124 在中枢神经系统中的表达最为丰富。在脑室区的神经祖细胞内，外泌体所含miR-124 的衰减会导致神经元分化减少，而表达升高则会促进神经元的生长[19]，并有神经保护的作用。另外，miR-17-92 可以通过抑制 PTEN 激活 PI3K 通 路 ,促进缺血半影区神经可塑性和神经功能的恢复[20]。如在卒中手术前2周天转染含有miR-210的腺病毒表达载体可以促进局灶性脑缺血/再灌注大鼠损伤脑区的神经再生，改善神经功能[21]。

（2）参与神经血管生成

血管新生需要大量生长因子，如血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor，FGF）。而外泌体能够将所包含的miRNAs 递送到脑内皮细胞中，促进内皮细胞迁移、增殖及血管生成。在脑缺血小鼠模型中，通过下调脑血管中miR-15a 的水平，可以提高FGF2 和VEGF 的表达，促进脑卒中周边区域的血管生成[22]。除了脑内皮细胞外，循环内皮祖细胞也参与血管新生。循环内皮祖细胞分泌的外泌体可将促进血管生成有关的miR-126 和miR-296 转移到受体内皮细胞中，促进血管生成[23]。研究表明，miR-126 的高表达可通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信号通路来提高内皮祖细胞血管形成的能力[24]。

另外，研究表明缺血性脑卒中后miR-124 在缺血半暗带中的表达水平升高，外泌体中的miR-124 可促进神经血管生成[19]。

（3）参与神经炎症反应

缺血性脑卒中后期继发的免疫炎症反应是造成脑损伤的重要原因之一。小胶质细胞是脑内介导炎症和免疫的主要效应细胞，持续激活介导脑缺血慢性期的炎症。激活的小胶质细胞有两种类型，分别称为经典激活的小胶质细胞和选择性激活的小胶质细胞，一般认为，M1 型的小胶质细胞可释放多种炎症因子,对大脑神经功能恢复将产生有害作用；而M2 型的小胶质细胞被认为具有抗炎作用。因而调整小胶质细胞的激活状态（分化类型）可以作为抗脑缺血损伤的治疗靶点。

目前发现，miR-155 可直接参与巨噬细胞的炎症反应，也可通过NF-κB 信号通路增强巨噬细胞促炎因子的表达。另外，miR-155 还可以通过靶向不同的炎症介质,如细胞因子信号抑制物1（Suppressor of cytokine signaling1，SOCS1）、转移生长因子β信号途径转导蛋白Smad2，起到促炎与抗炎的双重作用[25]；miR-124 还具有重要的抗炎作用,在巨噬细胞内，miR-124可以通过减少信号传导及转录激活因子3（Signal transducers and activators of transcription3，Stat3）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）促使抗炎；另外，miR-124-3p 可促进小胶质细胞向抗炎的M2 表型分化，有利于神经重塑[26]。在卒中手术前后经侧脑室注射miR-210抑制剂则可以抑制炎症反应和减轻脑损伤[27]。

3 外泌体源性miRNAs与卒中后抑郁

卒中后抑郁（Post-stroke depression，PSD）是卒中后的情绪障碍常见的并发症，其因卒中造成的心境障碍，患者存在对事物丧失兴趣、抑郁的情绪或其他伴随的4个症状（睡眠障碍、身体不适、能力下降、悲观无价值感），且这些症状持续多于2 周[28]。PSD 约占卒中患者的25%-40%[28]，在卒中发生后2 周内就有出现PSD 的报道。PSD 不仅影响患者的生存质量，也妨碍神经功能的恢复，并可能会加重脑卒中的发病率、残疾率和死亡率。由于部分患者存在认知及言语障碍，所以PSD的发生不易察觉，但严重影响患者的预后。

PSD 的病理生理机制十分复杂，脑缺血引起的神经功能障碍和心理应激均参与其中。目前发现，PSD与单胺神经递质的改变、下丘脑-垂体-肾上腺轴的异常、神经可塑性、神经炎症和谷氨酸神经递质等改变有关。

3.1 PSD的发病机制

目前广泛认为PSD 与单胺类神经递质水平的降低有关，由于脑部缺血阻断了神经递质从脑干向大脑皮质的运输，导致了边缘系统、额叶、颞叶、基底核区神经递质利用率下降，破坏调节情绪的额叶-纹状体-苍白球-丘脑-皮质环路［29］，从而使得区域性5-羟色胺和去甲肾上腺素合成减少，诱发抑郁。

近年发现促炎/抗炎平衡的破坏与PSD 的发生有关。促炎因子可能通过上调吲哚胺2，3 双加氧酶（Indoleamine2,3-dioxygenase，IDO）编码基因的表达（该基因的表达可以使色氨酸向犬尿酸代谢增加，从而减少5-羟色胺的合成）引起相关抑郁症状出现[30]。同时，促炎因子可刺激下丘脑-垂体-肾上腺皮质释放皮质醇，皮质醇对中枢神经系统具有慢性损害作用，提示其与卒中患者病情恶化及死亡率升高有关。

神经元的再生与神经生长因子有关，其中重要的神经生长因子是脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）。BDNF 是体内含量最多的神经营养因子，主要在中枢神经系统内表达，其中海马和皮质的含量最高。目前已有实验证实海马神经元的萎缩及再生障碍与抑郁症状的产生密切相关，而抗抑郁药物可增加海马神经元再生[31]。另外，神经胶质细胞特别是星形胶质细胞的变性或功能障碍在抑郁的发病中也起着重要的作用，神经胶质细胞源性营养因子的主要功能是维护神经元和神经胶质细胞，保护其免受氧化应激的影响。

研究表明，外泌体源性miRNAs 参与到上述各个PSD 发病机制中，随着miRNAs 在神经元中表达水平的改变，PSD 的神经递质释放、神经免疫炎症反应、BDNF 含量等与PSD 相关的发病因素均发生了不同程度的改变，说明miRNAs 表达水平的改变对PSD 有重要意义。探讨不同种类miRNAs 在PSD 中的作用，将更深入的在分子水平上发掘PSD的潜在机制。

3.2 外泌体源性miRNA在PSD中的作用

3.2.1 通过生物因子调节PSD

去甲肾上腺素能神经元和5-羟色胺能神经元的破坏可引起去甲肾上腺素和5-羟色胺减少，导致抑郁发生。miRNAs可通过上调5-羟色胺的信号转导的作用调节PSD的发生发展。

此外，神经发生与PSD 中行为的恢复密切相关，海马齿状回中的新生细胞在卒中后显著增加，助于改善PSD 患者的学习和记忆能力。卒中后神经元的新生，可能会转移到受损部位并取代受损神经，从而改善卒中后的神经功能。大脑中存在丰富的miR-124，其可以调节信号传导、促进胚胎干细胞分化为神经元，研究表明，大脑中的miR-12a 在卒中发生后显著降低，将miR-124 引入到神经祖细胞当中，发现其抑制了神经组细胞的增殖，促进神经元的分化，并可调节5-羟色胺的释放[32]。针对类似miR-124 对神经元的特定作用导致5-羟色胺的改变，miR-124 等其他miRNAs可能成为卒中后促进神经发生的重要因子。

3.2.2 通过炎症因子调节PSD

卒中患者中，免疫介导的动脉粥样硬化斑块炎性侵润被认为是动脉粥样硬化的标志。同时，卒中通过启动一系列的炎症反应促进神经细胞死亡并诱导星形胶质细胞再生，促进受损神经的重塑。

炎症细胞因子是PSD 发病机制中的重要因素。研究表明，特定miRNAs 可以作用于一些炎症因子，通过激活这些因子从而激活5-羟色胺，增加其含量，这对于PSD 的治疗有重要意义。在细菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激肥大细胞炎症因子分泌过程中miRNAs 的表达差异研究中，发现miR-126、miR-155 在炎症刺激前后存在差异性表达[33]。其中，miR-126 与血管内皮新生密切相关，能增强新生血管的生成，改善卒中脑缺血状态来调节PSD[34]；miR-155能够抑制血清白介素-4（Interleukin-4，IL-4）、白介素-5（Interleukin-5，IL-5）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-10（Interleukin-10，IL-10）的表达，促进海马神经元再生，使得前额叶皮质神经可塑性功能得到恢复，从而抑制PSD的发展[35]。

通过研究卒中后神经炎性反应与外泌体中相关miRNAs 的关系，来调节大脑细胞间通讯，可能帮助延缓或降低PSD的发病几率。

3.2.3 通过神经生长因子调节PSD

许多miRNAs 共同作用于BDNF 来影响PSD 的进展。同时BDNF也可以诱导部分miRNAs的合成，调节神经发生。BDNF 是脑内合成的一种蛋白质，与突触及神经可塑性关系密切，研究证明BDNF 可调节突出结构、突触连接和神经传递的数量，参与神经细胞的增殖和分化[36]。突触中的miR-132通过调控GTP酶活化蛋白，增加对BDNF 的反应，从而调控神经发生，过度表达的miR-132可以增强突触生长和轴突发生。

研究结果表明，卒中后抑郁患者血清BDNF 水平下降，miR-132 水平增加。当BDNF 水平较低时，能显著上调神经元中的miR-132 表达，反之当抑制miR-132 时，可以提高BDNF 的转录水平[37]。表明miR-132与BDNF 间存在反馈作用。说明miRNAs 与BDNF 间的相互关系在PSD发病中起重要作用。

在PSD 的抑郁状态患者中，神经胶质细胞源性营养因子及其mRNAs的表达水平均下降，且神经胶质细胞源性营养因子减少与PSD 的严重程度呈正相关［38］。其中，miR-124被发现通过与脑转录因子相结合，调节5-羟色胺依赖性突触的可塑性，从而改善PSD 的抑郁状态[32]。

3.2.4 其他方面

一些外泌体源性miRNAs，如miR-192、miR-219调节与昼夜节律相关的基因表达，这可能与PSD 的睡眠障碍和情绪障碍相关[39]。

研究表明，特定miRNAs 与应激性抑郁有关，其中包含miR-124，其增加可以下调糖皮质激素受体的表达，同时减少BDNF，可能对应激诱导的PSD 发挥作用。另外，miR-137 特异性结合于Grin2A mRNA 的3'非翻译区，下调N-甲基-D-天氡氨酸离子能谷氨酸受体 2A（Recombinant Glutamate Receptor，Ionotropic，NMethyl-D-Aspartate 2A，Grin2A）蛋白表达，从而抑制与抑郁相关的N-甲基-D-天冬氨酸（N-MethylD-aspartic acid，NMDA）受体的过度激活，降低PSD 患者抑郁症状[40]。

就近几年的研究结果来看，目前仅是发现了多种编码的外泌体源性miRNAs 能通过调节体内因子的水平来影响卒中及卒中后抑郁的发展，对其调节过程的掌握及控制仍是一大难题。我们或许能通过发现特定miRNAs 在PSD 潜在人群中的表达异常，实现对PSD发生的及时预测，增强对PSD防治的实际意义。

3.3 PSD治疗进展

3.3.1 药物及非药物治疗

目前治疗PSD 主要以抗抑郁药物为主，分为选择性5-羟色胺再摄取抑制剂、去甲肾上腺素再摄取抑制剂及特异性5-羟色胺能抗抑郁药三类。此外，对于药物依从性差、药物应答不良和不宜药物治疗的患者常采用认知行为疗法。

3.3.2 新的治疗方向——外泌体源性miRNAs治疗

在PSD 中，外泌体参与了神经可塑性及神经炎症的过程，并且miRNAs 和mRNAs 的水平变化的异常表达可能影响神经重构及炎症反应导致PSD 的加重。考虑到近年来Notch 与JAK/STAT 信号串话及Notch 信号通路重塑小鼠神经的分子机制得到了进一步挖掘，加之对 miR-124、miR-126、miR-155 在神经元重塑、神经血管生成的方面也有较多研究，本文从外泌体源性miRNA 在卒中及卒中后抑郁的作用机制出发，为之后相关的临床试验提供理论依据，期望在不久的将来能出现针对这些miRNAs 作为PSD 的靶向基因标记的相关疗法，这对PSD 及其他神经精神疾病的防治有重要意义。

4 中医与外泌体源性miRNAs

中国传统医学治疗方式，如中药、针灸、艾灸等，被多次研究应用于PSD 治疗，效果相较于对照组有明显效果[41]。其中姜黄素外泌体已被发现可以使脑卒中大鼠的神经轴突重塑，并且其神经其功能也得到了改善；旋覆花内酯（Acetylbritannilactone，ABL）通过抑制miR-155 表达来下调 TNF-α和 IL-1β的水平，从而起到抑制炎症反应的作用。旋覆花内酯通过抑制miR-155 介导的炎症反应而发挥脑保护作用目的[19]；与抑郁症发病相关的海马内13 个特异性miRNAs 中，miR-125a 和miR-182 在中药柴胡疏肝散干预后恢复正常,说明这两个miRNAs 可能是中药柴胡疏肝散抗抑郁的作用靶点[42]，其如何影响抗抑郁机制还有待进一步研究。

探讨中医治疗对外泌体及内源性物质miRNAs、mRNAs、蛋白质的影响，对预防或延缓PSD 具有重要的临床意义，对中医药的发展也具有重要的促进作用。