基于网络药理学探析复方麦孜彼子口服液治疗慢性非细菌性前列腺炎的作用机制＊

吉米丽汗·司马依，买买提明·努尔买买提，艾尼瓦尔·吾买尔，季志红，阿地力江·萨吾提，买尔旦·玉苏甫，周文婷＊＊

（1. 新疆医科大学药学院药理学教研室 乌鲁木齐 830011；2. 新疆医科大学维吾尔医学院 乌鲁木齐 830011；3. 新奇康药业股份有限公司 乌鲁木齐 830011）

慢性非细菌性前列腺炎（Chronic Abacterial Prostatitis，CAP）是多种复杂的原因和诱因引起的炎症、免疫、神经内分泌参与的错综的病理变化，又称为慢性骨盆疼痛综合征（Chronic Pelvic Pain Syndronmes，CPPS），导致以尿道刺激症状和慢性盆腔疼痛为主要临床表现。有国内报道称[1]，慢性前列腺炎（Chronic Prostatitis，CP）在 30-40 岁和 61-70 岁之间男性中的发病率为6.0%-32.9%，发病率近35%。其中，90%以上为CAP。目前，床上对其病程的不同，使用抗生素，适当辅助给予α-受体阻滞剂、肌肉松驰剂、抗氧化剂、激素类等药物。此类药物虽然会减轻相关的症状，但是会导致小便频数、余沥不尽、腰膝酸软、头晕目眩、寐差耳鸣、早泄梦遗等不良现象，不宜长期使用。中药现代研究结果显示，中药对其效果明显，不仅减少相应的症状，还减轻疼痛，副作用少[2-4]。治疗CAP 的中药不仅具有抗炎和抗感染，还有改善微循环、免疫调节和调节前列腺液pH 环境等特点[5]，会增强机体细胞和体液免疫功能，从而达到抵御炎症因子入侵的作用[6-8]。

西帕依麦孜彼子口服液（Xipayimaizibizi Liquid，XmL）是中医学（维医方向）临床常用、代表性的治疗CAP 的经典复方，由桑椹、芡实、金樱子和栀子等4 味中药组成，其具有抗炎，改善微循环、免疫调节的功效，还能够有效地减轻疼痛不适的症状。朱翠玲等[9]研究，桑葚提取物抑制炎症相关因子表达量，产生炎性免疫反应，从而减弱促炎症反应，发挥抗炎功效。樊修和等[10]研究，芡实正丁醇部位分离组分具有对H2O2 诱导的PC12（神经细胞株）细胞有神经保护作用。已有研究表明[11]，栀子苷能抑制细胞的免疫应答，同时能明显降低细胞中TNF-α、IL-1β、前列腺素的含量，在对神经系统炎症治疗中发挥着积极作用。刘相文等[12]研究表明，金樱子多糖的提取物对各类病毒感染的治疗具有独特的药物作用优势。

综上可以看出XmL 的4 味草药的共同功效是防御病原体的感染、调节免疫以及神经分泌功能。XmL本药也有已研究的报道，如XmL联合甲磺酸多沙唑嗪缓释片的综合治疗方法更能有效地减轻患者排尿不畅、疼痛不适等症状，耐受性较好，其可能成为临床治疗CAP 有效的中西医结合治疗方案，值得在临床治疗上大力推广和应用[13]。遗憾的是，目前XmL 的抗炎、抗感染，改善微循环、免疫调节、前列腺液作用机制尚未系统的描述。本文通过网络药理学系统的描述XmL的作用机制，为今后的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 通过TCMSP数据库进行DL和OB筛选

将成分根据ADME 的类药性（Drug-likeness, DL）和药物口服生物利用度（Oral bioavailability,OB）等参数筛选了入血活性成分。其中DL 是指与良好的临床疗效相关联的物理化学性质（如溶解性、稳定性等）及生物学特性（即吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMETox））[14-18]。OB 是指制剂中药物被吸收进入人体循环的速度与程度。本研究选取DL ≥0.18、OB ≥30 的化合物进行进一步研究。

其中A 是给定草药成分的分子描述，B 代表该性质在Drugbank 数据库（https://www.drugbank.ca/）中所有分子的平均值。

表1 XMB“复方-成分-靶点”基本信息

1.2 候选化合物和候选靶点的筛选

候选化合物和候选靶点的筛选：通过Cytoscape3.6.0 软件构建候选化合物-候选靶点网络图，按照Degree和Betweenness的大小顺序再进一步筛选化合物和靶点。

1.3 潜在靶点的筛选

潜在靶点的筛选：①通过TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）数据库并结合已报道CP 发病机制相关文献挖掘出其相关的靶点。②通过CTD（http://ctdbase.org/）数 据 库“Urogenital disease（male）”中“Proteinuria”“Homo sapiens”为关键词筛选出 CAP 相关的潜在靶点。

1.4 GeneMANIA 基因分析

GeneMANIA 基因分析，即 GeneMANIA（http://genemania.org/）数据库“Homo sapiens”为关键词下载全部基因进行分析基因的功能、基因表达和优先基因排序等[19]各基因之间相互关系。

1.5 通路分析与网络构建

将潜在基因导入生物学信息注释数据库DAVID6.8（https://david.ncifcrf.gov/）通 过 基 因 本 体（Gene Ontology,GO）生物过程和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）对靶点进行代谢通路富集分析。最后，使用Cytoscape 3.6.0 软件构建复方-潜在化合物-潜在靶点-通路网络图。

2 结果

2.1 活性成分的筛选结果

将TCMSP数据库和已报道的文献中找出的XmL中4味草药的263个化合物和4511个靶点通过OB和DL方法筛选得到24个化合物和1002个靶点。（见表1、表2）

2.2 候选成分-候选靶点预测结果

将24个化合物和1002个靶点通过Cytoscape 3.6.0软件的Degree 和Betweenness 参数的大小顺序筛选出前10 个候选化合物和候选靶点（表3、表4），构建复方-候选化合物-候选靶点网络图（Herb-potential compounds-potential targets network，HB-pC-pT）（图1）。

表2 XmL中活性成分的OB和DL筛选结果表

2.3 潜在化合物-潜在靶点的预测结果

将 1002 个靶点按 Degree ≥ 5 筛选出的 72 个靶点和 24 个化合物导入 CTD 数据库，“Urogenital disease（male）”中“Proteinuria”“Homo sapiens”为关键词筛选出10 个潜在化合物和其对应的57 个CAP 特异性靶蛋白，并进行了靶向研究。

2.4 基因分析结果

GeneMANIA 分析结果显示，57 个靶点相互作用中，各基因之间的Co-expression 是42.27%、Physical Interaction是28.10%。（图2）

2.5 通路分析与网络构建

GO 分析结果为57 个潜在基因涉及到生物过程（biological process） biological regulation、metabolicprocess、cellular process 等127 个；分子功能（molecular function）catalytic activity、binding、molecular transducer activity 等 78 个；细胞组分（cellular component）：cell、mambrace、organelle 等 58 个；通路（Pathway）：CCKR 信号通路、促性腺激素释放激素受体途径细胞凋亡信号通路等164 个信号通路等（图3）。通过DAVID 数据库（P≤ 0.05）进行通路分析（表5）。结果表明，57个潜在靶点参与的主要通路为PI3K-Akt信号通路、TNF 信号通路 MAPK 和 AMPK 信号通路、NF-κB 信号通路、HIF-1信号通路、Toll样信号通路和P53信号通路等与人体识别病原体，产生免疫反应有关的信号通路。甲状腺激素信号通路、雌激素信号转导通路、血清素能突触、胆碱能突触、心肌细胞中的肾上腺素信号和唾液分泌等与神经，内分泌密切相关的信号通路。而色氨酸代谢和钙信号通路等人体的代谢密切相关的信号通路。最后，通过Cytoscape 3.6.0 软件构建复方-潜在化合物-潜在靶点-通路网络图(图4)。

表3 根据Degree和Bentweenness筛选XmL的前10个候选化合物

表4 根据Degree和Bentwenness筛选XMB的前10个候选基因

图1 复方-候选化合物-候选靶点网络图

图2 利用GeneMANIA分析潜在靶点网络

图3 Go分析：分子功能（1），细胞组分（2），生物过程（3），信号通路（4）

表5 潜在靶点的KEGG通路富集分析（P ≤0.05）

3 讨论

DL 是指与良好的临床疗效相关联的物理化学性质（如溶解性、稳定性等）和生物学特性（即吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADME-Tox））。DL 越大，则成药性越高。以系统药理学方法来分析传统中医药时，DL ≥0.18 为筛选生物活性成分的标准。OB 是指制剂中药物被吸收进入人体循环的速度与程度。反映所给药物进入人体循环的药量比例，OB 描述口服药物由胃肠道吸收，及经过肝脏而到达体循环血液中的药量占口服剂量的百分比，OB ≥30 为筛选生物活性成分的标准[20-21]。如表2所示，4味草药中有24个化合物符合DL 和OB 的标准，并且4 味草药的化学成分中均存在槲皮素（Quercetin）。槲皮素[22]通过 NF-κB 和MAPK信号通路对大鼠CAP有保护作用。金樱子与芡实中的β-谷甾醇和芡实中豆甾醇具有抗雄激素的作用，抑制巨噬细胞的迁移和巨噬细胞介导的基质细胞增殖而发挥治疗CAP的作用[23]。

图4 复方-潜在化合物-潜在靶点-通路网络图

24 个化学成分通过TCMSP 数据库整理相应的靶点，使用 Cytoscape 3.6.0 软件 Degree 和 Betweenness 参数[24]，进行刻画网络节点的程度分析并筛选前十个候选化合物和候选靶点（表3、表4）。候选靶点筛选结果分 别 为 ：PTGS2、PTGS1、NCOA2、HSP90AA1、PRKACA、DPP4、BCL2、JUN、CASP3 和PPARG 等候选靶点（Degree ≥9）。候选化合物筛选结果为槲皮素（Degree = 154、Betweenness = 0.1830）帕列最前，其次山奈酚（Kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、甘露醇（Mandenol）、β-胡萝卜素（Beta-carotene）、桑色素（morin）、藏花酸（crocetin）、苏丹3（Sudan III）、3-甲基山奈酚（3-Methylkempferol）和豆甾醇（Stigmasterol）等10 候选化合物。其中前5个化合物是4味中草药共有的成分〔图1（1）和图1（2）〕，推测5个化合物为XmL的主要候选化合物。然后，此5 个候选化合物和对应的靶点再通过Cytoscpe3.6.0 软件构建网络图〔图1（3）〕。按Degree 来表示候选靶蛋白圆形的大小，Degree 越大圆形半径越大，关联的化合物数量就越多。其中能与候选化合物关联度大于2 的靶蛋白有PTGS2、BCL2、JUN、CASP3、PTGS1、CASP9、CYP1A2、AKT1 、HMOX1和GABRA1等候选靶蛋白。此10个靶点与上述10 个候选靶点均有PTGS2、BCL2 、JUN、CASP3 和PTGS1等靶蛋白。推测此5个靶点为XmL的主要候选靶蛋白。

XmL 的 24 个成分和 Degree ≥ 5（72 个靶点）的靶蛋白通过CTD 数据库筛选结果为XmL 的10 个潜在化合物及其对应的57个CAP特异性靶蛋白，并进行了靶向研究（见图5）。10个潜在化合物分别为：槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、β-胡罗卜素、维生素E、花青素、异欧前胡素、藏花酸、豆甾醇和桑色素等潜在化合物。将57 个潜在靶蛋白通过GeneMANIA 数据库分析各基因之间的关系（见图3）。结果提示了这些化合物的变化会对XMB 治疗CAP 的成分-靶点网络稳定性和完整性产生较大影响，从而改变其治疗CAP 的疗效。其中的有些潜在靶点已有文献报道，如刘颖等[25]研究发现，PPAR-γ 治疗 CAP 可以通过抑制 NF-κB 的活化来抑制炎症和免疫反应；王龙等[26]研究发现，前列腺炎的炎症可通过上调Bcl-2 蛋白参与其对CAP细胞凋亡的调节和也可能通过影响CASP3 激活参与抑制CAP 细胞凋亡。这些研究结果充分说明，XmL 的各成分和相应的基因之间在治疗CAP中相辅相成，协同发挥作用。

GO 和KEGG 通路分析中作为Pathway 注释分类的主要公共数据库。表5 显示为57 个靶点参与了18个主要信号通路（P≤0.05），信号通路网络可以看出第三排的10 个信号通路，即PI3K-Akt 信号通路（Counted gene = 10）、TNF 信号通路（Counted gene =7）、MAPK 信号通路（Counted gene= 7）、AMPK 信号通路（Counted gene = 5）、NF-κB 信号通路（Counted gene = 4）、HIF-1 信号通路（Counted gene = 5）、Toll 样信号通路（Counted gene = 5）、P53 信号通路（Counted gene = 5）、VEGF 信号通路（Counted gene = 4）和cGMP-PKG 信号通路（Counted gene = 5）等与人体识别病原体，产生免疫反应有关的信号通路。第二排的信号通路是甲状腺激素信号通路（Counted gene= 7）、雌激素信号通路（Counted gene = 6）、血清素能突触（Counted gene=6）、胆碱能突触（Counted gene=6）、心肌细胞中的肾上腺素信号通路（Counted gene = 5）和唾液分泌信号通路（Counted gene = 4）等与神经，内分泌密切相关的信号通路。而第一排的信号通路为色氨酸代谢（Counted gene = 3）和钙信号通路（Counted gene=6）等人体的代谢密切相关的信号通路。有关上述信号通路已有研究报道，如槲皮素通过NF-κB 和MAPK信号通路对大鼠CAP有保护作用，王强等[27]研究发现，p38 MAPK 信号通路在治疗CAP 中起着重要作用。除了这些信号通路意外，还涉及癌症有关的信号通路。结果显示，XmL能够从神经-内分泌-免疫，代谢等方面参与人体防御病原体入侵，而发挥治疗CAP作用。

4 结论

本研究通过DL 和OB 方法合并，应用CTD 数据库筛选复方麦孜彼子口服液中4 味草药的10 种活性化合物，由18个主要信号通路中的57个潜在靶点发挥其治疗慢性非细菌性前列腺炎的作用，体现了中药多成分、多靶点协同作用的特点。从网络角度，本研究提供了复方麦孜彼子口服液治疗慢性非细菌性前列腺炎潜在靶点的系统观点，需要进一步的实验来验证。