云南高海拔粳稻区白叶枯病菌致病力差异分析

和建平 杨雅云 张斐斐 董超 阿新祥 汤翠凤 张恩来 申时全 戴陆园,*

（1 云南省农业科学院高山经济植物研究所，云南 丽江674199；2 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所/云南省农业生物技术重点实验室/农业农村部西南作物基因资源与种质创制重点实验室/农业农村部云南稻种资源科学观测实验站，昆明650223；#共同第一作者：apingping122@163.com；*通讯作者：luyuandai@163.com）

水稻白叶枯病是世界上最严重的水稻细菌性病害之一，水稻受到白叶枯病菌侵染后，一般减产20%～30%，严重时甚至绝收[1]。1991—2014年，全国稻作区水稻白叶枯病发生面积为28.09～89.07 万hm2，损失稻谷14 312～158 992 t[2]。水稻白叶枯病是我国南方和长江中、下游籼稻区的重要水稻病害，2010—2013年这几个地区通过国家审定的水稻品种共103 个，其中，中感品种31 个，感、高感品种64 个，未发现有高抗或抗病品种[3]。水稻白叶枯病在云南冷凉粳稻区的危害也逐渐严重，从海拔76 m 的河口县至2 647 m 的宁蒗县，已有105 个县的水稻发生此病害[4]，特别是在海拔2 200 m 的剑川县，白叶枯病已成为当地最严重的水稻病害[5]。稻黄单胞菌属水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. Oryzae，Xoo）为水稻白叶枯病的病原细菌。史波等[6]用人工接种方法鉴定了云南、吉林、浙江等6 省75 个水稻主栽品种对我国白叶枯病菌9 个小种（R1～R9）的抗性，发现云南省主栽品种抗性弱、抗谱窄，只对其中3 个小种有抗性，在高海拔粳稻生产上使用的粳稻品种凤稻15 号、楚粳24 号和凤稻17 号等受害严重。采用抗病品种是防治水稻白叶枯病最经济有效的方式之一。弄清各地白叶枯病菌的致病类型，分析水稻主栽品种对白叶枯病菌的抗性情况，是有效利用抗病品种防治病害的基础。陈深等[7]对采集自华南地区不同生态稻区的150 个白叶枯病菌株进行致病性检测，发现V、IV致病型和R8、R5 小种为华南稻区优势种群，IX 致病型毒性最强且发展快；强致病菌系V 型已成为华南优势致病菌系。云南具有丰富的稻种资源，不同海拔稻区水稻白叶枯病菌群体毒性、致病型组成和类型复杂多样，这可能与云南的地理条件有关[8-10]。云南高原粳稻区水稻白叶枯病菌的致病型种类已由2003年的10 种不断发生变异，增加了许多新的致病型[5，11-12]。和建平等[13]采用3 套不同的鉴别品种对新采集的云南高原粳稻区的白叶枯病菌的致病型进行鉴定，发现少了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ7 种致病型，出现另外7 种新致病型。在长期的进化过程中，菌株致病力形成了专化性，所以许多抗病基因都只能对白叶枯病菌的部分菌系起作用，呈现出不同的菌株致病力和品种的抗性差异。本研究通过分别利用余腾琼等[5，15-16]确定的3 套鉴别品种，对采集分离自云南省内海拔1 837 m 以上粳稻区的32份白叶枯病菌株进行菌株致病力差异分析研究，剖析云南高海拔粳稻区白叶枯病菌的致病力与海拔高度、经纬度、采集品种类型的相关性，以及致病型与品种抗性的关系，以为云南高海拔粳稻区水稻抗病育种和生产提供理论指导。

表1 32 份菌株及其采集病叶的品种、种植地、海拔

1 材料与方法

1.1 供试菌株

本研究供试菌株均由本实验室2009年采集自11个不同水稻品种上分离获得的32 份菌株，采集后由本实验室保存。菌株来自8 个采集地6 个海拔点（1 837～2 350 m），具体见表1。

1.2 鉴别品种及种植方法

以余腾琼等[5，15-16]构建的3 套共15 份鉴别品种为材料。余腾琼等鉴别品种为毫糯扬、TN1、黄玉、珍珠矮、IR26、南粳33 和金南风，方中达等鉴别品种为金刚30、Tetep、南粳15、Java14、IR26，许志刚等鉴别品种为金刚30、IRBB14、IRBB3、IRBB4、Java14、IRBB5。

将上述15 个鉴别品种播种于云南省西双版纳州农业科学研究所嘎洒镇试验田，单行种植，10 株/行，株行距15 cm×20 cm，单本种植。肥水管理同当地常规管理，防虫不防病。

1.3 接种方法

采用剪叶接种法。接种前用PSA 培养基复壮菌株，28 ℃培养72 h，用无菌蒸馏水洗下菌苔，再用麦法兰分度计比浊法配成浓度为6×108cfu/mL 的菌液。在水稻孕穗期，于15∶00 后接种，在菌液配制后3 h 内完成接种。接种时每个品种选取上部完全展开叶片，叶片长度短于20 cm 的，剪去2～3 cm；长于20 cm 的，剪去4～5 cm[17]。

1.4 分级标准和方法

接种21 d 后进行调查，每个材料调查10 张接种叶片，计算平均病斑长度，根据平均病斑长度进行分级。分级标准：平均病斑长度小于或等于6.0 cm 为抗病（R）；大于6.0 cm 为感病（S）。

1.5 数据分析

品种感病率是指某个鉴别品种上致病性菌株数占总参试菌株数的百分比；菌株致病率是指该菌株接种后导致感病的品种数占总供试品种数的百分比。根据致病力的分级结果，计算致病型频率（致病类型的数量／总菌株数×100%）。用SPSS17.1 软件中Pearson 相关性分析方法分析菌株致病率、致病型频率分别与海拔、地理距离、采集品种推广面积等的相关性。

采用系统聚类分析中的最短距离法计算各地区水稻白叶枯病菌群体间致病力的欧氏距离。根据病样采集点的地理坐标计算不同地区群体间的地理距离，以Mantel 测验对各地区水稻白叶枯病菌群体间致病力的欧氏距离与地理距离间的相关性进行分析。

2 结果与分析

2.1 云南高原粳稻白叶枯病菌的致病力差异分析

32 个供试菌株的致病率变幅为0～73.33%。采集自剑川县的18 个菌株平均致病率为32.59%，楚雄州6个菌株平均致病率为53.33%，丽江市8 个菌株平均致病率为39.17%，剑川县的菌株致病力最弱。在楚粳28号上所采集的4 个菌株平均致病率最高为55.00%，致病力最强；致病力最弱的为剑粳3 号上的8 个菌株，平均致病率为29.17%。单个毒性最强的为楚粳28 号和楚粳26 号上的菌株CX28-3、CX30-1，致病率达73.33%；毒性最弱的为剑粳3 号上的菌株JC12-2，致病率为0。

图1 15 个鉴别品种的感病率表现

采集自不同水稻品种的有些菌株不仅致病率相同，而且致病型也相同。如：同一采集地楚雄州姚安县旧城村楚粳26 号上的菌株CX30-1 与楚粳28 号的菌株CX28-3 致病率均为73.30%，致病型同为RSSSSSS型（余腾琼鉴别品种，下同）、SRSSS 型（方中达鉴别品种，下同）、SRSRSS 型（许志刚鉴别品种，下同）；大理州剑川县金华镇中登村的剑粳3 号上的菌株JC2-2 与花谷上的菌株JC3-1 致病率均为46.67%，致病型同为Ⅹ型、Ⅵ型、C1 型；大理州剑川县剑粳3 号的菌株JC1-1与丽江市玉龙县楚粳26 号上的菌株LJ17-1 及LJ17-2致病率均为20.00%，致病型同为RRRSRSS 型、0 型、0型；大理州剑川县的剑粳6 号上菌株JC6-1 与大理州剑川县剑粳3 号上的菌株JC12-1，致病率为13.30%，致病型同为Ⅳ型、0 型、0 型。采集自同一水稻品种的菌株的致病率和致病型都相同，如分离自楚雄州姚安县旧城村云粳19 号上的菌株CX29-1 与CX29-3，致病率为33.33%，致病型同为RRRSRSS 型、Ⅰ型、SRSRRR型；丽江市玉龙县大新乡保夫洛村的楚粳28 号上菌株LJ18-1 与LJ19-1 致病率均为33.33%，致病型同为Ⅹ型、Ⅶ型、SRRRSR 型。这些致病率和致病型一致的菌株很可能为同一菌系。

2.2 鉴别材料对参试菌株的抗性反应

15 个鉴别材料对菌株表现出了不同的抗感性。如图1 所示，毫糯扬、IRBB14（Xa-14）和IRBB4（Xa-4）对所有菌株表现高抗，没有供试菌株使其感病；Tetep（Xa-2，Xa-16）也表现出高抗，只有1 个菌株能使其感病；IRBB5（xa-5）有4 个菌株使其感病，品种感病率12.50%；南粳33 感病率最高，达到了93.75%，其次为珍珠矮、金南风和金刚30，品种感病率都在70.00%以上，这4 个品种较为感病。TN1（Xa14）、黄玉（Xa1，Xa12）和IRBB3（Xa3）的感病率较为接近，分别为43.75%、43.75%和40.63%。

2.3 水稻白叶枯病菌株致病力分化与地理区域的关系

从病菌在鉴别品种上产生的平均病斑长度和致病率来看，病菌采集地海拔高度与病菌的病斑长度不相关，相关系数r=-0.770（p=0.073＞0.05）；同样，病菌采集地的海拔高度与病菌的平均致病率的相关性也不显著，r=-0.691（p=0.058＞0.05）（表2）。由此看出，采集自高海拔粳稻区的白叶枯病菌的病斑长度和致病率均与海拔高低没有相关性。

从病菌在3 套鉴别品种上反应的致病型来看，病菌采集海拔与白叶枯病菌的致病型频率之间相关性不显著，相关系数r=0.763，p＞0.05（表2）。8 个采集点粳稻白叶枯病菌群体间的致病力欧氏距离为0.00～4.164（表3）。对致病力的欧氏距离矩阵与相对应的地理距离矩阵进行Mantel 测验，数据点呈上升趋势，相关系数r=0.355（P=0.034＜0.05）（图2），说明菌株间的致病力分化与地理距离相关性显著，有96.6%的致病力变异可以由地理距离解释，3.4%的致病力变异是由其他因素决定的（见表3）。

2.4 来源于不同品种的菌株致病力与品种推广面积的关系

笔者采集白叶枯病菌株的11 个云南水稻品种，主要适宜在1 500～2 400 m 的高海拔地区种植。据资料统计，楚粳28 号2009年在云南省推广面积12.44 万hm2，采集自楚粳28 号的白叶枯病菌株平均致病率为56.67%，为最高的菌株致病率；剑粳3 号2009年在剑川县的种植面积达0.77 万hm2，采集的白叶枯病菌平均致病率为29.17%，为菌株致病率最低值（表4）。水稻品种的种植面积与分离自各品种的病菌致病率呈极显著相关，相关系数r=0.730（p=0.001＜0.05）。由此可见，云南省高海拔粳稻区水稻品种，种植面积越大，从其上采集的白叶枯病菌株致病率越高，反之亦然。

从白叶枯病菌株致病类型和采集品种面积的关系来看，没有呈现出规律性，相关系数r=-0.470，p=0.145＞0.05，因此，不同水稻品种的白叶枯病菌株致病类型频率与采集品种面积大小没有相关性。

3 结论与讨论

表2 采集自不同海拔和经纬度的菌株群体平均病斑长度、平均致病率及致病型频率

表3 水稻白叶枯病菌群体间致病力的欧氏距离（对角线以下）与地理距离（km，对角线以上）

图2 水稻白叶病菌群体的致病力欧氏距离与地理距离间的相关性

云南稻区因其独特的地理环境和多变、立体的气候，再加上丰富的稻种资源，各海拔区域种植的水稻品种有差异，水稻白叶枯病菌与水稻在长期的互作过程中，导致云南稻区白叶枯病菌生理小种组成十分复杂，在往年实验结果中发现新的致病型不断出现[5，13-14]。云南白叶枯病菌遗传多样性也明显高于国内其他省份，且存在显著差异，其中以中海拔稻区最高，低海拔稻区次之，高海拔稻区最低[18]。本研究发现，云南高原粳稻白叶枯病菌株，在不同水稻品种和不同海拔区域采集的菌株品种感病率和菌株致病率存在差异，致病力最强的菌株为楚雄州的菌株CX28-3 和CX30-1，致病率为73.33%；最弱的为大理州剑川县的菌株JC12-2，致病率为0；即使来自同一地区同一品种上的菌株致病力也不同。在高海拔粳稻区，菌株的致病力分化与采集地的海拔高度无关，却与地理距离、采集品种的推广面积相关；采集自不同水稻品种的部分菌株致病率一致，但菌株致病型则不同。在不同地区间和同一地区菌株致病力分化与采集地海拔不相关，但与经纬度（地理距离）显著相关，这与李成云等报道的云南白叶枯病菌株致病力与海拔高度相关的结果不一致[19]，表明云南高海拔粳稻白叶枯病菌的特殊性。但有趣的是，不同地点不同品种上采集的一些菌株的致病率和致病型都一致，但是否为同一个菌株，需要通过下一步菌株的基因组测序才能确定，其形成原因也有待继续研究。说明云南稻区白叶枯病菌生理小种组成具有复杂性和多样性[18-20]。本研究中，高原粳稻白叶枯病菌株致病力强弱与采集品种的面积大小呈显著相关，因此，我们认为同一地区内应交替轮换种植多个水稻品种，尽量避免单一水稻品种的大面积种植，才能有效控制强致病力的水稻白叶枯病菌导致的病害大流行和大爆发。同时，我们应加强对云南高原白叶枯病菌变异机制的深入研究，探索其致病力分化与水稻的协同进化关系，才能进一步对水稻白叶枯病进行有效防控。

表4 分离自不同品种的菌株致病型频率及采集品种推广种植面积

我国对白叶枯病抗性稻种资源筛选进行了广泛的研究。王明明等[22]采用我国和菲律宾的6 个Xoo 代表菌株，评价了来源于我国26 个省份的174 份水稻微核心种质资源对白叶枯病的抗性，发现6 个粳稻品种（包括云南的鸡血糯）和7 个籼稻品种对2 个或2 个以上的菌株具有抗性[21]。余腾琼等[22]鉴定出云南省不同种植生态区的186 份地方稻抗性材料和22 个野生稻抗性居群。海南省25 个水稻白叶枯病菌生理小种，仅有含xa5、Xa7、Xa23、Xa27 基因的鉴别品种对它们有抗性[23]。东北三省的121 个白叶枯病菌分属于6 个小种，含Xa2、xa5、Xa7、Xa23、Xa27 的鉴别寄主对它们有抗性[24]。本研究中15 份水稻鉴别品种对32 个菌株表现出了不同的抗感性，含抗性基因xa5 的IRBB5 抗性较强，只有5 个菌株能使其感病，说明xa5 这个基因从10年前到现在都还能在水稻生产上保持抗白叶枯病的特性，这与前人的对xa5 基因抗性研究相似[11，25-26]，值得推广利用。本研究还发现含抗性基因Xa2 和Xa16 的Tetep、含Xa4 的IRBB4 和毫糯扬对32 个参试菌株都表现高抗，本实验室近期将毫糯扬抗性基因初步定位于11 号染色体的1.2 cM 的区间内，与其他已知的13个抗白叶枯病基因不同，该基因在云南高海拔粳稻区具有较大的开发和利用价值。另外，IRBB14 和TN1 同含抗性基因Xa14，IRBB14 高抗，而TN1 有14 个菌株能使其感病，说明IRBB14 中可能还含有其他抗性基因。而姬广海等[27]对云南水稻白叶枯病菌115 份供试菌株在16 个水稻品种上的致病性进行鉴定，41 个菌株使IRBB14 品种致病，69 个菌株使IRBB4 品种致病。这与本研究的结果不同，说明云南高原粳稻白叶枯病菌的致病力随时间发生了变化。聚合多个抗性基因的品种一般对白叶枯病表现为抗，但在本研究中只有Tetep 表现出高抗，黄玉（Xa1，Xa12）和Java14（Xa1，Xa3，Xa12）都表现出了较高的感病性，这说明现在云南高原粳稻白叶枯病菌开始出现了能克服含Xa1，Xa3 和Xa12 基因的新小种。鉴别品种毫糯扬、IRBB14（Xa14）、IRBB4（Xa4）和Tetep（Xa2，Xa16）表现出较好抗性。本研究所用的鉴别品种由于抗性基因是已知的，鉴定结果也能较好地反应出病菌致病性的差异，对云南高原粳稻区水稻白叶枯病抗性基因的布局具有较大的参考价值。