HPV 抗原表位及其在疫苗中的应用综述

张文祺，郑博升，王昱俨，马晓玲，王 琳，邱其其，刘 伟

1 河北医科大学基础医学院，河北石家庄 050051；2 河北医科大学基础医学院免疫教研室，河北省重大疾病的免疫机制及干预重点实验室，河北石家庄 050017

宫颈癌是全世界妇女第4 大最常见的癌症，目前超过50 万女性被诊断患有宫颈癌[1-2]。作为高危人群的高龄妇女及可通过母婴传播的孕期女性应被重点关注[3-4]。而宫颈癌的发病主要与人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的持续感染有关[5]。在所有确定的“ 高风险”HPV 中，HPV 16 型(HPV16)与HPV18 型(HPV18)占所有子宫颈癌病例的70%以上，其持续感染是全世界绝大多数宫颈癌的原因[6-7]。HPV 形态小，无包膜，为双链DNA 病毒。HPV 基因组可分为三个区域：长控制区(long control region，LCR)，早期开放阅读框(early open reading frames，EORF)和晚期开放阅读框(late open reading frames，LORF)。而HPV 病毒阅读框则由以下组成：EORF 中三个参与转录和复制的调控基因(E1，E2 和E4)；癌基因(E5，E6和E7)；LORF 中两个编码自组装蛋白基因(L1 和L2)。L1、L2 编码的蛋白质可以构成病毒衣壳。目前市场上三种HPV 疫苗，都是以非传染性重组特异性L1 衣壳蛋白为基础组装成病毒样颗粒(viruslike particles，VLP)，并以VLPS 的形式纯化作为免疫原，其中九价HPV 疫苗具有预防高达90%宫颈癌病例的潜力。高风险HPV 中最重要的两个基因是E6 和E7，这是病毒的关键致癌基因。E6、E7可通过影响p53 抑癌基因和视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，PRB)来促进肿瘤的发生[8-9]。在宫颈组织中，E7 似乎是产生生殖道癌早期阶段的显性癌基因，而E6 则促进肿瘤的后期进展。因为这两种蛋白质的序列在广泛的HPV 亚型中都得到了很好的保护，所以两种癌蛋白被认为是使用疫苗治疗干预HPV 相关肿瘤的潜在靶标[10]。本文综合近几年关于HPV 疫苗的研究，旨在指出不同表位的特性与优缺点，为新疫苗的制备提供参考。

1 L1 相关表位

L1 是HPV 的主要衣壳蛋白，作为一种潜在的制作疫苗的成分，已经得到了广泛的研究[11]。因为L1 蛋白的互变性与可变性低于L2，且L1 序列内的保守区域中存在的表位多于L2 蛋白，这些区域将作为中和抗体的主要靶标[12]。目前已上市三种疫苗(表1)的免疫原均是以非传染性重组特异性L1 衣壳蛋白为基础组装成的VLP，多重的L1结构域能赋予VLP 抗原显著的免疫原性。免疫原性表位是病毒的重要抗原成分，根据各自的受体不同，表位可分为B 细胞表位和T 细胞表位，同时表位也可分为线性表位和构象表位[13]。

1.1 线性表位 线性表位是由保守氨基酸组成。最近一项实验发现可以利用这些线性表位作为工具进行疫苗研发，结果表明DRB1*1501 和DQB1*0602 等位基因和HLA-DRB1*1501 和DQB1*0602等位基因仅分别与HPV16 和HPV18 宫颈癌阳性相关。同时预测了表位序列EEYDLQFIFQLCKITLTA和HPV16 的L1 蛋白的RHGEEYDLQFIFQLCKITLT A、LPDPNKF、PETQRLVWAC、PVPGQYDA、YNP ETQRLVWAC、DTGYGAMD；HPV18L1 蛋白的PV PGQYDATK、KQDIPKVSAYQYRVFRV、RDNVSVD YKQTQLCI 和YSRHVEEYDLQFIF，这些表位均有潜力作为一种工具研制新的HPV 疫苗。同时，这些表位具有芳香族氨基酸(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)，其免疫原性也随之增加，但预测出表位的具体效果仍需更多实验进一步验证[12]。

1.2 构象表位(HPV16) 在HPV 病毒中，HPV16是HPV 生殖器官和口腔癌症中最常见的致癌基因型，我们以HPV 16 为例阐述L1 构象表位研究的最新进展。1)H16.U4 相关：H16.U4 是一种类型特异性单克隆抗体，能被包括L1 蛋白C 末端的HPV的构象依赖性中和表位所识别。冷冻电子显微拷贝图像重建技术(CRYO-EM)将HPV16 与抗体(Fab)H16.U4 片段的结构复合后研究鉴定抗原表位。结果表明，H16.U4 单克隆抗体在L1 蛋白C 端臂上独特的结合模式可以定位一个重要的结构和构象表位，进而识别HPV 衣壳不同成熟阶段的细微构象变化，为分析病毒感染早期HPV 摄取机制提供了关键的探针。这些分析准确地定义了HPV16 衣壳上重要的构象表位，是预防HPV 疫苗成功的关键目标，H16 U4 则是研究这些构象表位的得力工具[12,14]。2)H16.V5，26d1 相 关：每 个L1 单 体 的核心都由β 链和α-螺旋结构组成，这些结构支撑着5 个表面暴露的环形区域，分别是BC、DE、EF、FG 和HI。不同基因型间的L1 氨基酸序列变异主要集中在表面暴露的环区内，这段区域决定了L1 中和抗体的特异性反应。L1 蛋白通过FG 和HI 环的赖氨酸残基与宿主硫酸肝素部分之间的相互作用介导初级病毒附着。近期CRYO-EM 证明，HPV16 一个单克隆抗体H16.V5 可识别来自两个相邻的L1 单体的环[15]。

表1 中国已上市三种HPV 疫苗相关信息

单克隆抗体26d1 是一种从记忆B 细胞中分离出来的人类中和抗体，它对HPV16 有特异性。DE和FG 环中包含26d1 和H16.V5 相互作用的关键表位。HI 环也是与H16.V5 相互作用的重要抗原区，而HPV16-L1 中的DEA 环也是26d1 的主要抗原识别区域，DEA 和FGB 环彼此非常接近，组成了构象结构与表位26d1 结合，可以被识别。DEA 环135-140(yaanag)和142-143(dn)位置的8 个氨基酸、FGB 环281-282 位置的2 个氨基酸(gs)和FGB 环285 位置的残基ASN(n)被预测为两个相邻L1 单体的构象表位，研究在DEA 环135-136(Ya)处发现一个线性表位，分析表示DEA 环上的135-143 残基主要与26d1 发生特定的相互作用。通过综合分析H16V5 和26d1 的复杂结构后发现，DEA 环上的4 个 残 基(ASN 138、ALA 139、ASP 142、ASN 143) 和FGB 环 的3 个 残 基(GLY 281、SER 282、ASN 285)都是H16.V5 和26d1 的共有表位[16]。

1.3 B 细胞和T 细胞表位研究发现HPV L1 蛋白中有4 个片段(H2、H4、H11、H12)含B 细胞表位，三个片段(H2、H3、H9)可能含中和表位。其中H11 和H12 片段中含有B 细胞表位的情况从未被报道过，H3 首次被发现为血凝抑制表位。详细的表位标测确定了HPV16-L1 位置301-310 处的氨基酸序列(tsdaqifnkp)为免疫原性B 细胞表位[17]。而 在HPV16-L1 中，B 细 胞 表 位H2(21-54aa)、H4(162-196aa)、H11(89-116aa)和H12(146-167aa)同样可以被识别。HI(血凝抑制实验)证实了H2(49-94aa)、H3(111-15aa) 和H9(474-505aa)产生的抗体具有很强的中和作用。这些表位有望作为人乳头瘤病毒疫苗的候选者。此外，H2 还含有一个关键的中和表位值得关注，这可能为更好地理解HPV16-L1 综合表位提供新的信息，也有助于HPV 疫苗的设计和临床应用[13]。另外，T 细胞对 免 疫后HPV16-L1 305-313 位HLA-A2- 和HLA-A24-限制性表位(QIFNKPYWL)的应答增加，提示HPV16/18 L1-VLP 疫苗能够同时诱导T 细胞和B 细胞的特异性免疫应答[17]。

2 L2 相关表位

L2 蛋白N 末端在不同类型HPV 中高度保守，且其诱导的抗体有交叉中和保护作用，这使得它在免疫HPV 方面相较于L1 更有优势。基于这一特性，L2 蛋白N-末端表位或将成为下一代HPV 疫苗研发的目标[18]。L2 蛋白N 末端只有氨基酸17-36的部分暴露于表面，主要用于病毒附着、病毒基因组组装及诱导低滴度的广泛交叉中和抗体。氨基酸17-36 处的中和表位被鉴定为RG-1 单克隆抗体的靶标，且是决定血清中和活性的主要因素[19]。其N 端存在L2 中和表位的 108-126 区域，该区域能通过上皮细胞表面的膜联蛋白A2 异四聚体(A2T)与上皮细胞结合并显示序列保护。同时，研究人员借助MS2 噬菌体、腺病毒载体等与L2 结合组装成新的VLP，这些混合VLP 可以产生L2 高滴度抗体，保护机体免受多种类型HPV 感染。

2.1 噬菌体MS2-VLP 疫苗 这是一种基于噬菌体MS2 病毒样颗粒的混合MS2-L2 候选HPV 疫苗。混合MS2-L2 VLP 由两个MS2-L2 VLP 的混合物组成，包括HPV31 和L2 肽(HPV16)的肽混合物(表位20-31)，以及一个一致的L2 肽(表位69-86)[20]。该疫苗与往常的注射疫苗不同，MS2 噬菌体疫苗加入了两种黏膜佐剂—霍乱毒素和单磷酸酯A。霍乱毒素是一种黏膜佐剂，与神经节受体结合，激活丝裂原活化蛋白激酶信号转导途径，从而激活免疫系统。单磷酸酯A 是一种经批准的疫苗佐剂，它可与B 细胞、树突状细胞和巨噬细胞上的TLR4结合在一起，激活myd88 信号通路，从而激活免疫系统使其可通过口服免疫。研究人员通过实验证明口服疫苗能保护小鼠免受HPV11、16、53 和56 的阴道感染和预防头颈、口腔的鳞状细胞癌[21]。

2.2 PfTrx-8-mer-OVX313 单肽疫苗 这一疫苗使用了氨基酸20-38 表位，这段表位涵盖了多达11种HPV 类型，在小鼠和豚鼠上能诱导出26 种黏膜型和皮肤型HPV 中和抗体反应。L2 八聚体VLP为合适的靶向结构，八聚体结合细菌硫代多辛蛋白(trx)和OVX313 构成抗原。抗原PfTrx-8-mer-OVX313 中加入了从嗜热链球菌(pftrx)提取的TRX蛋白，使其具有优异的耐热性[22]。而OV313 来源于补体抑制剂C4 结合蛋白(C4bp)的一种七重化结构域(Heptamerization)，它大大提高了抗原的免疫原性[23]。PfTrx-8-mer-OVX313 单肽疫苗不仅具有很好的成本效益，而且还克服了很多VLP 疫苗的局限性[24]。

2.3 基于腺病毒的HPV-L2 疫苗 HPV-L2 是已开发的一种基于罕见的人类腺病毒类型35(HAdV35)载体的候选疫苗，通过蛋白质IX(pIX)混合了来自4 种不同HPV 类型的L2 蛋白表位。混合的两个异源HAdV35 pIX-L2 显示载体呈现9 个高度保守的线性表位HPV 类型，每个HAdV35 pIX-L2 都具有良好的可塑性，HAdV35 pIX-L2 载体在不添加佐剂的情况下就可以诱导出有效交叉反应性体液免疫[25]。基于成熟的AdV 平台，腺病毒疫苗十分具有潜力，它被证实能对病原体(如艾滋病毒、埃博拉细菌等)产生强有力的B 细胞和T 细胞反应，并具有良好的安全性[26]。HAdV35 pIX-L2 有望成为下一代覆盖面广且预防性良好的HPV 疫苗[27]。

2.4 鞭毛素-L2 疫苗 将Rg1 表位融合到自适应鞭毛素-L2 疫苗中，可增强对不同HPV 基因型皮肤攻击的持久保护。在没有外源佐剂的情况下接种Fla-HPV 16 L2 11-200 融合蛋白对HPV 16 具有持久的保护作用，但对其他类型HPV 的交叉保护作用有限[28]。若将HPV 6/18/31/39/52 的L2 残基17-38 加入Fla-HPV 16 L2 11-200 或11-88 中，可通过主动或被动免疫而获得更广泛的保护[29]。

3 E6、E7 相关表位

3.1 CpG 疫苗 E6、E7 是引起细胞癌变的关键蛋白，因此针对E6、E7 蛋白开发治疗HPV 相关肿瘤的免疫治疗方法成为理想的目标，在E7 蛋白片段中加入佐剂设计治疗性HPV 疫苗已成为当前HPV 疫苗研究的新热点。有研究者将含有CD8+T细胞表位(E7 49-57)和两个CD4+T 细胞表位(E7 49-57 和E7-50-62)的HPV16 E7 43-77 肽作为抗原，并在其中加入CpG 寡核苷酸1826 作为佐剂设计出一种CpG 疫苗。单一疫苗同时诱导抗原特异性CD8+T 细胞和CD4+T 细胞可以更有效地治疗HPV，因为CD8+细胞毒性T 细胞在清除HPV 感染细胞和HPV 转化的肿瘤细胞中起重要作用，而CD4+T 细胞在启动CD8+T 细胞的生成、扩展、维护以及协调抗体产生方面发挥重要作用。CpG 寡核苷酸(odn)是一种具有较强免疫刺激活性的物质，它能通过TLR9 信号通路来增强Th1 免疫反应，因此常用来作抗肿瘤辅助药物。将其加入E7 43-77抗原肽中制成疫苗，可以抑制免疫抑制细胞的表达如调节T 细胞(Tregs)、骨髓源性抑制细胞(mdsc)和巨噬细胞，并有效阻止肿瘤的形成[30]。

3.2 特异性表位肽 作为靶抗原设计疫苗除了E6E7 蛋白的突变体和CpG 疫苗，使用特异性表位肽作为靶抗原设计HPV 治疗性疫苗也成为免疫领域的研究重点，尤其是具有引发特异性免疫应答能力的T 细胞表位，它可以避免天然蛋白质诱导的免疫抑制并增强免疫特异性和免疫效应[30]。设计治疗性肽疫苗的基本原理：在B 细胞反应不能清除已建立的细胞内病毒癌蛋白情况下，病毒特异性抗体仍可用于抑制病毒蛋白进入新细胞[31]。Wang 等[32]通过预测人白细胞抗原(HLA)-A2 限制性细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)表位肽，得到6 种来自HPV58 E7 蛋白的肽，为 p1(e77-15：tleyildl)、p2 (e77-15：dheptdl)、p3(e769-77：cstttdv)、p4(e772-80：stttedvrtl)、p5(e779-81：tlqllmgt) 和p6(e788-91：llcttct iv)，所得表位肽可用作制备HPV58 治疗性表位。肽疫苗的候选表位肽疫苗因其具有诱导单一特异性免疫应答的能力而受到越来越多的关注。目前，评估HPV 治疗性多肽疫苗的研究集中于HPV E6 和E7 蛋白及其CTL 表位。HPV E6 和E7蛋白含有多个CTL 表位，如ctla-4 等对HLA Ⅰ类分子具有高亲和力。因此，我们可以鉴定具有强免疫原性和高特异性的表位肽[33]。该过程是制备治疗性HPV 多肽疫苗的关键。

4 结语

本文对近年来HPV L1、L2、E6、E7 等的主要抗原表位的研究结果进行描述。关于L1 疫苗的研究前期已经相当充分，近年来对其的研究都集中在可以帮助进一步研制疫苗的各类表位工具上。L2 疫苗的中和表位相比L1 疫苗能诱导出更加广泛的抗体，而像MS2、腺病毒等载体可以赋予L2 疫苗各种特性来弥补自身的局限。E6、E7 的相关疫苗也有了新的进展。未来HPV 疫苗的研究会更加深入，若L2 单肽疫苗、E6E7 表位肽疫苗，CpG疫苗等具备很大潜力的疫苗能够成功研发，将会是全球HPV 感染者的福音。