VDR 基因多态性与耐多药肺结核的关联

刘 幸，孙 辉，杜映荣，陈 洁，欧阳兵，张 乐

（1）昆明市第三人民医院药剂科，云南昆明 650041；2）重症医学科；3）结核科，云南昆明 650041）

耐多药肺结核（multi-drug resistant tuberculosis，MDR-PTB）是指至少对异烟肼和利福平两种一线抗结核药物同时产生耐药性的肺结核，2017 年世界卫生组织（world health organization，WHO）报道，全世界MDR-PTB 的治愈率为54%，死亡率高达16%，我国的MDR-PTB治愈率仅有41%，我国也是全世界30 多个耐多药结核病的高负担国家之一，在我国每年新发MDR-PTB 病例数居世界第二[1]。VDR（vitamin D receptor，VDR）基因在染色体12q 上编码的维生素D 受体，具有多种单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），有研究称VDR 基因与结核病的易感性有关[2-3]，但均未对耐药人群进行分层研究，目前也未发现云南地区汉族人群VDR 基因与MDR-PTB 易感性的报道。本研究选取了目前VDR 基因研究较多的FokI、TaqI 位点作为研究对象，探索云南地区汉族人群VDR 基因单核苷酸多态性与耐多药肺结核发生的关联性，并寻找出易感基因的影响因素。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取昆明市第三人民医院2017 年01 月01 日至2018 年12 月31 日期间就诊的云南省汉族MDR-PTB 患者为研究对象，共纳入300 例患者作为感染组，门诊体检健康人群300 例作为对照组。其中感染组男性181 例，女性119 例,年龄18～70岁，平均（34.5±4.3）岁；对照组男性165 例，女性135 例，年龄18～70 岁，平均（39.4±2.6）岁，两组研究对象的性别和年龄差异均无统计学意义（χ2=1.749，P=0.186；t=0.243，P=0.654），具有可比性。

1.2 纳入标准

（1）云南省内地区的汉族人群；（2）年龄在18-70 岁之间，性别不限；（3）临床确诊为MDR-PTB 的患者，诊断依据为《中国结核病防治规范实施工作指南（2008 年版）》[4]；（4）胸部影像检查证实有肺内病变者；（5）入组前4 个月痰培养结果阳性者；（6）自愿加入本研究并签署知情同意书

1.3 排除标准

（1）肺炎、肺癌和尘肺等患者；（2）非广泛耐药结核病患者，排除菌种鉴定为非结核分枝杆菌感染的患者；（3）有严重并发症者；（4）肝功能损害：丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平高于实验室参考范围上限的2.5 倍；（5）肾功能损害:血清肌酐水平≥265 μmol/L；（6）心血管疾病、糖尿病患者；（7）妊娠期或哺乳期妇女；（8）HIV、长期使用激素、器官移植等免疫功能低下的患者。

1.4 实验方法

DNA 的提取及纯度测定：所有外周血样本通过酚/氯仿抽提核酸法提取DNA,试剂盒由北京天根生物工程公司提供。VDR 基因FokI 位点引物为：5'-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3'和 5'-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3'，VDR 基因TaqI 位点引物为：5'-CAGAGCATGGACAGGGAGC-3'和5'-AGGAGAGGCAGCGGTACTG-3'，均由擎科生物（昆明）有限公司合成。FokI的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增体系：反应总体系30 μL，DNA 模板1 μL，上游引物和下游引物各1 μL，PCR Mix 15 μL，ddH2O 12 μL。Fok I 的PCR 扩增条件：预变性94℃5 min、变性94 ℃30 s、退火64 ℃30 s、延伸72 ℃30 s、72 ℃未延伸5 min，共35 个循环。扩增片段长度267 bp。TaqI 的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增体系：反应总体系50 μL，DNA 模板2 μL，上游引物和下游引物各2 μL，PCR Mix 25 μL，ddH2O 19 μL。TaqI的PCR 扩增条件：预变性94℃5 min、变性94℃30 s、退火59℃30 s、延伸72℃30 s、72℃未延伸10 min，共35 个循环。扩增片段长度455 bp。以DL-2000 为标准分子量对照，用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物。纯度测定以A260/A280＞1.7 为合格，合格的样本送擎科生物（昆明）有限公司进行测序。

1.5 基因型的影响因素分析

对感染组进行分层分析，收集感染组患者的性别、年龄（＜60 岁、≥60 岁）、职业（农民、工人、其他）、居住地（农村、城镇）、文化程度（小学以下、小学～大专、大专以上）、初/复治、耐药情况（仅耐一线抗结核药物、耐一线和二线抗结核药物）、抗结核药物暴露史（未使用过一线和二线抗结核药物、仅使用过一线抗结核药物、使用过一线和二线抗结核药物）、是否产生过药物不良反应、是否合并结核性胸膜炎、肺部病灶类型（干酪型、浸润型）、服药的依从性作为自变量。依从性参考Morisky 依从性性量化表（MMAS）进行评估是否规律服药。以基因型（野生型、突变型）作为因变量，对自变量进行单因素分析，筛选出的变量进行二分类logistic 回归多因素分析。

1.6 统计学处理

数据通过Excel 2016 软件整理录入，应用SPSS 20.0 软件进行统计分析。Hardy-Weinberg 遗传平衡定律、两组间基因型及等位基因频率分布、单因素分析采用χ2检验，多因素分析采用二分类Logistic 回归分析，检验水准ɑ 值取双侧0.05。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg 遗传平衡检验

VDR 基因Fok I 位点FF、Ff、ff 基因型在感染组的数量分别为89，137，74；在对照组中的数量分别为99，160，41；均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡检验（χ2=2.136，P=0.144；χ2=3.505，P=0.061），样本均具有代表性。VDR 基因Taq I 位点TT、Tt、tt 基因型在感染组的数量分别为167，109，24；在对照组中的数量分别为185，98，17；均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡检验（χ2=1.069，P=0.301；χ2=0.696，P=0.404），样本均具有代表性。

2.2 VDR 基因Fok I、Taq I 位点的基因型和等位基因频率分布的情况

测序后发现VDR 基因Fok I 位点的多态性均含有FF、Ff、ff 基因型，感染组的分布频率分别为：29.8%、45.5%、24.7%，对照组的分布频率分别为：33.0%、53.3%、13.7%。通过χ2检验发现3 种基因型分布频率差异有统计学意义（χ2=11.783，P=0.003）。等位基因F 在感染组中的分布频率为52.5%，在对照组中的分布频率为59.7%，等位基因f 在感染组中的分布频率为47.5%，在对照组中的分布频率为40.3%，两组间的分布频率亦差异有统计学意义（χ2=6.256，P=0.012）。VDR 基因Taq I 位点的多态性均含有TT、Tt、tt 基因型，感染组的分布频率分别为：55.8%、36.4%、7.8%，对照组的分布频率分别为：61.7%、32.7%、5.6%。通过χ2检验发现3 种基因型分布频率差异无统计学意义（χ2=2.700，P=0.259）。等位基因T 在感染组中的分布频率为73.8%，在对照组中的分布频率为78.0%，等位基因t 在感染组中的分布频率为26.2%，在对照组中的分布频率为22.0%，两组间的分布频率亦无统计学意义（χ2=2.849，P=0.091），见表1。

2.3 VDR 基因Fok I、Taq I 位点多态性与MDR-PTB 发生的关系

在分析VDR 基因Fok I 位点多态性与耐多药肺结核发生的关系中发现，ff 基因型的分布频率具有统计学意义（χ2=8.303，P=0.004），等位基因f 的分布频率亦具有统计学意义（χ2=6.256，P=0.012）。此数据表明VDR 基因Fok I 位点多态性与MDR-PTB 易感性有关，其中基因型ff 增加了MDR-PTB 的易感性（OR:2.008，95% CI:1.246，3.235），等位基因f 亦增加了其的易感性（OR:1.388，95%CI:1.065，1.682）。而在VDR 基因Taq I 位点多态性与耐多药肺结核发生的关系中，突变基因型和等位基因的分布频率均无统计学意义（P＞0.05），此数据表明VDR 基因Taq I 位点多态性与MDR-PTB 易感性无关，见表2。

表1 VDR 基因Fok I、Taq I 位点的基因型和等位基因频率分布［n（%）］Tab.1 Genotype and allele frequency distribution of Fok I and Taq I loci in VDR gene［n（%）］

表2 VDR 基因Fok I、Taq I 位点多态性与MDR-PTB 的关系［n（%）］Tab.2 Relationship between the polymorphism of VDR gene Fok I and Taq I and MDR-PTB［n（%）］

2.4 基因型的影响因素分析

由表2 数据得知，VDR 基因Fok I 位点ff 基因型可增加MDR-PTB 的易感性，为求寻找影响基因型的非遗传因素，以感染组中野生型（FF）和突变型（Ff、ff）基因作为因变量进行分层回归分析。结果显示，患者的依从性（χ2=6.875，P=0.009）、药物的不良反应（χ2=4.278，P=0.039）、合并结核性胸膜炎（χ2=8.479，P=0.004）差异具有统计学意义；而患者的性别、年龄、职业、居住地、文化程度、初/复治、耐药情况、抗结核药物暴露史、肺部病灶类型的差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。

将单因素分析中的所有因素作为自变量，基因型作为因变量进行二分类Logistic 回归分析。结果显示，患者的依从性、药物的不良反应、合并结核性胸膜炎是突变基因型的独立影响因素，其中患者的依从性是突变基因型的保护因素（OR=2.583，95%CI=1.342～4.287），药物的不良反应（OR=0.162，95%CI=0.094～0.432）、合并结核性胸膜炎（OR=0.249，95%CI=0.026～0.278）是突变基因型的危险因素，见表4。

3 讨论

在感染性疾病中，遗传因素与非遗传因素均能影响病原体对宿主的表达，结核分枝杆菌也不例外。本研究通过探索云南地区汉族人群VDR 基因多态性与MDR-PTB 的关系中发现，VDR 基因FokI 位点的ff 基因型是MDR-PTB 的易感基因。同时对感染组进一步分析发现，VDR 基因FokI 位点突变可能对患者的服药依从性、是否合并结核性胸膜炎以及药物的不良反应有一定的影响。

在1988 年VDR 基因被首次克隆成功，其包含8 个内含子和9 个外显子，可编码427 个氨基酸，在染色体12q 上编码的维生素D 受体（VDR），是维生素D 主要代谢产物1,25-(OH)2-D3 的关键作用受体，VDR 的多态性位点FokI 位于第2 个外显子的起始密码上，有研究证明，当该位点发生突变时，VDR 将从第2 个密码子开始翻译，从而导致翻译出的氨基酸仅有424 个，比正常VDR 编码的蛋白质少了3 个氨基酸[5]。VDR 基因的Taq I 位点位于第9 个外显子上，其多态性是由第352 个异亮氨酸密码子突变造成的[6]。巨噬细胞是抵御结核分枝杆菌的主要效应细胞，当机体细胞启动免疫应答时，巨噬细胞对结核分枝杆菌具有吞噬作用[7]。维生素D 可以促进巨噬细胞的生成，当结核分枝杆菌侵袭机体时，巨噬细胞可以启动免疫应答，并分泌大量的细胞因子，进而刺激T 淋巴细胞分泌IFN-γ，同时维生素D 亦可以抑制抗原呈递细胞过度刺激T 淋巴细胞，从而避免分泌过多的TNF-α 引起免疫损伤[8]。

表3 感染组中基因突变的单因素分析［n（%）］Tab.3 Single factor analysis of gene mutation in the infected group［n（%）］

表4 感染组中基因突变的Logistic 多因素分析Tab.4 Logistic multivariate analysis of gene mutation in the infected group

VDR 基因功能缺失与多种疾病的发生有关，比如：乳腺癌、糖尿病、银屑病、骨质疏松、多发性硬化、类风湿性关节炎、恶性黑色素瘤等[1]。机体内维生素D 的缺乏也可以使结核病的发病率增加[9]，金武等[10]的研究发现，拥有FF 基因型和Ff基因型的患者体内维生素D 的含量明显高于ff 基因型，ff 基因型的患者体内维生素D 合成不足，更加易感结核。在细胞核上维生素D 受体的表达数量和空间构象，以及与维生素D 形成复合物的能力均能影响其生物学性能[7，11]。在全球范围内，VDR 基因多态性与结核病的易感性不尽相同，说明VDR 基因多态性存在地域差异。有研究发现，VDR 基因FokI 位点中ff 基因型可降低维生素D 受体与维生素D 形成复合体并且对抗结核分枝杆菌的作用，ff 基因型是结核病的易感基因[12-13]，另一项研究表明，结核患者ff 基因型的分布频率显著性高于健康人群[14]，这些结论与本研究结果一致。国内也有较多的类似研究，一项关于初治肺结核的汉族人群研究显示，VDR 基因的杂合型Ff 基因型与结核病的发热症状有关，发热是活动性肺结核的主要症状之一，提示Ff 基因型是活动性肺结核的保护因素[15]。虽然在本研究中，Ff 基因型感染组的分布频率为45.5%，低于对照组的53.3%，亦是耐多药肺结核的保护因素，但不具有统计学意义（P=0.794），说明活动性肺结核与耐多药肺结核的基因多态性可能具有一定区别。一项关于河南省结核患者的易感性分析显示，VDR 基因的FF基因型是结核发病的保护因素（OR=0.72,CI:0.55～0.93），说明等位基因F 的突变，能增加结核病的易感性[16]。在两项关于少数民族的研究中显示，新疆维吾尔族人群的VDR 基因多态性与结核病的易感性无关，而在新疆哈萨克族人群的研究中显示，Fok I 位点的等位基因f 与结核病的易感性有关[17-18]，国内一项Meta 分析结果显示，VDR 基因的Fok I 位点的ff 基因型是结核病的易感基因[19]。这些结论与本研究结果相同。但在另一项研究中发现，VDR 基因的FokI 位点与机体的维生素D 含量没有相关性，也不会增加结核病的易感性[20]。在伊朗的结核患者中的研究显示，VDR 基因的Fok I位点与易感性无关[21]。国外一项Meta 分析结果显示，VDR 基因的Fok I 位点与结核病的易感性无关[22]。这些可能与地域关系有关，也可能与国内外的诊断标准及治疗方案不尽相同有关。

VDR 基因的Taq I 位点中，T 等位基因通常被认为是结核病的易感基因，t 等位基因被认为是保护基因[18]，在结核患者中的t 等位基因往往非常稀少，但在本研究中，感染组和对照组的t 等位基因分布频率分别为26.2%和22.0%，显示感染组的t等位基因并未显著下降，这可能与MDR-PTB 患者在后期治疗中的免疫重建有关。在印度人群中的研究显示，VDR 基因的Taq I 位点多态性与女性结核病患者的易感性有关[23]。一项关于东亚与西亚人群的Meta 分析显示，VDR 基因的Taq I 位点与结核病的易感性也有关[24]。但在我国藏族人群的VDR 基因研究中，Taq I 位点多态性与结核病的易感性无关[25]，非洲人群的研究也显示，VDR 基因的Taq I 位点与结核病的易感性无关[26]。在我国江苏省人群的一项研究显示，VDR 基因的Taq I 位点亦与结核病的易感性呈弱相关[27]。Lee 等[28]进行的Meta 研究也显示，VDR 基因的Taq I 位点与结核病的易感性无关，这些结论与本研究结果一致。目前存在这样的差异，可能与民族、地域以及非遗传因素有关。

为求进一步研究VDR 基因FokI 位点ff 基因型对MDR-PTB 的影响，本研究选取了多个非遗传因素进行logistic 回归分析。结果显示，VDR 基因FokI 位点突变可能对患者的依从性、药物的不良反应与合并结核性胸膜炎有一定的影响，这3 个因素与一项耐多药肺结核的影响因素分析结果相同[29]，也间接反映了基因型ff 与MDR-PTB 的关系。在依从性方面，由于MDR-PTB 的疗程较长，患者的经济与心理压力较大，容易造成不规律服药的情况发生。在本研究中发现，基因突变型患者未规律服药的比例为68.2%，显著高于基因野生型患者的比例51.7%，说明FokI 位点的突变的患者更容易发生未规律服药的情况，亦更容易引起耐药的发生。长期治疗和疾病本身带来的痛苦会使患者长期处于慢性消耗状态，会降低MDR-PTB患者的生存质量[30]。通过提高患者的依从性，可提高患者的生存质量，也能减少耐药情况的发生。有研究显示[31]，社会家庭的支持对MDR-PTB 患者的依从性有一定的帮助。家庭的陪伴、临床护理途径、格林护理模式等也有助于提高治疗的依从性[32]。在不良反应方面，患者通常会因为难以耐受药物的不良反应而自行中断治疗，从而降低治疗依从性。多项研究显示[33-34]，药物不良反应的发生会影响患者治疗的依从性。在本研究中基因突变型的不良反应发生率为46.9%，显著高于基因野生型的发生率33.7%，也高于包昌琳等[29]的报道（38.6%）。说明FokI 位点突变的患者可能更容易发生药物不良反应。但在李凤丽等[35]的研究中发现，药物不良反应的发生未对患者的依从性产生影响，这可能与医务人员进行过集中培训有关，对患者进行跟踪督导，使患者了解诊疗过程中可能发生的药物不良反应类型及应对措施，培训患者疑似即报，及时就医。这些措施可以降低药物不良反应的发生，从而提高依从性。在合并症方面，本研究选择了常见的合并症结核性胸膜炎作为观察对象，其中基因突变型患者合并结核性胸膜炎的发生率为79.6%，野生型患者合并结核性胸膜炎的发生率为62.9%，说明FokI 位点突变的患者可能更容易发生结核性胸膜炎。Soborg C 等[26]的研究报道显示，肺结核合并结核性胸膜炎的发生率为35.2%，在合并症类型中排名第一。本研究发生率较高的原因可能是选择的样本均为MDR-PTB 患者，并且病情较重，易并发结核性胸膜炎，而且结核性胸膜炎不易获得组织标本，病检率较低，也是其发生率高的原因之一。临床应当加强组织标本的收集和耐药监测，在治疗过程中，应当充分考虑合并症的情况，在治疗的序贯、药品的选择和交叉感染等方面应当充分权衡[36]。

结核病是由多种基因之间的协同作用，或者是不同基因与环境之间的相互作用所导致[37]。在不同地域中开展结核病遗传基因的流行病学调查，有助于揭示基因组学在结核病发病中的作用，阐明结核病的发病及耐药机制，目前VDR 基因对结核病易感性的致病机制尚不清楚，仍需更多的不同地区与不同民族的大样本分析结果，为致病机制研究提供理论基础，为结核病的防控贡献力量。