仙人掌果多酚的提取及抗氧化活性研究

贾金滏，马超，张明，范祺，王崇队，张博华，孟晓峰，贾洪玉，杨立风*

（1.中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东济南 250014；2.山东农业大学，山东泰安 271018；3.山东农业工程学院，山东济南 250100）

多酚是含有苯环与酚羟基结构的化合物的总称。作为植物体内重要的次生代谢产物，植物多酚是果蔬营养品质的主要决定因素之一[1]。有研究表明，天然来源的植物多酚具有显著的抗氧化活性[2]，能有效预防高血脂、高血糖以及心脑血管疾病等现代疾病的发生[3-4]。近年来，随着人们生活水平的提高，消费需求更趋向于绿色、营养和保健。植物多酚作为一种理想保健品原料，其衍生出的功能性食品越来越受到消费者的青睐。

仙人掌（Opuntia stricta）为仙人掌科、仙人掌属植物，原产于南/北美洲，广泛分布于亚、非、美洲的热带与亚热带地区，在我国主要集中在西南及华南沿海地区[5]。仙人掌果为仙人掌植物的果实，果肉中含有丰富的多糖、有机酸、蛋白质、氨基酸、膳食纤维、维生素、矿物元素、多酚类等[6]。吉雪慧等[7]、马丹雅等[8]分别从仙人掌果中提取了花色苷及黄酮类物质，并对这些物质的提取工艺进行了优化。目前，仙人掌果实仅少量被采食，深加工利用较少，关于仙人掌果实总多酚的研究报道相对更少。鉴于此，本文对仙人掌果中多酚类物质的提取条件进行了优化，并对其抗氧化活性进行了初步评价，以期为仙人掌果实在食品、药品以及化妆品等领域的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：新鲜仙人掌果，采摘于2018 年10 月，购于山东恒宝食品集团有限公司。

试剂：没食子酸（99%）、DPPH（96%），上海麦克林生化科技有限公司，均为分析纯。福林酚（BR）、碳酸钠、抗坏血酸、无水乙醇等，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

仪器：ME204E/02 型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SHA-B 型恒温水浴振荡器，江苏杰瑞尔电器有限公司；TDL-5-A 型低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；Vortex-3 型旋涡混合仪，上海嘉鹏科技有限公司；UV1000 型单光束紫外/可见分光光度计，上海天美科学仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；N-1100 型旋转蒸发仪，SB-1100 型恒温水浴锅，上海爱朗仪器有限公司；FD-2型冷冻干燥机，上海比郎仪器制造有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品预处理

采购新鲜的仙人掌果实，经真空冷冻干燥，粉碎过筛（250 μm），避光保存。

1.2.2 标准曲线的绘制

采用Folin-Ciocalteus 法[9]，准确称取没食子酸标准品0.100 0 g，去离子水超声溶解，定容至100 mL，得到1 mg/mL 没食子酸标准储备液，用去离子水稀释至40 μg/mL，冷藏备用；分别准确移取0、0.125、0.250、0.375、0.500、0.625、0.750、0.875、1.000 mL 没食子酸标准储备液（40 μg/mL）于试管中，去离子水补至1.0 mL，分别加入1 N 福林酚试剂1.0 mL，室温反应3 min；分别加入10%Na2CO3溶液1.0 mL，30 ℃条件下反应30 min，于760 nm处测定吸光度，并进行线性分析。

1.2.3 仙人掌果多酚提取含量测定

精确称取仙人掌果冻干粉0.5 g，以一定浓度乙醇溶液为提取溶剂进行水浴振荡提取，3 000 r/min 离心5 min，过滤，定容至50 mL，冷藏备用，参照1.2.2 进行多酚含量测定。

1.2.4 单因素试验

（1）提取温度对仙人掌果多酚提取效果的影响

称取0.5 g 仙人掌果冻干粉，在乙醇浓度60%，料液比1:40（g/mL）的条件下，选择提取温度为30、40、50、60、70℃，水浴振荡提取45 min，冷却，3 000 r/min 离心5 min，过滤，定容至50 mL，参照1.2.2 测定多酚含量，平行3次，研究不同提取温度对仙人掌果多酚提取效果的影响。

（2）提取时间对仙人掌果多酚提取效果的影响

称取0.5 g 仙人掌果冻干粉，在乙醇浓度60%、料液比1:40（g/mL）、提取温度50 ℃的条件下，水浴振荡提取15、30、45、60、75 min。其他步骤同（1），研究不同提取时间对仙人掌果多酚提取效果的影响。

（3）料液比对仙人掌果多酚提取效果的影响

称取0.5 g 仙人掌果冻干粉，在乙醇浓度60%、温度50 ℃、提取45 min，的条件下，选取料液比1:20、1:30、1:40、1:50、1:60（g/mL）。其他步骤同（1），研究不同料液比对仙人掌果多酚提取效果的影响。

（4）乙醇浓度对仙人掌果多酚提取效果的影响

称取0.5 g 仙人掌果冻干粉，分别选取乙醇浓度20%、40%、60%、80%、100%，在料液比1:40（g/mL）、提取温度50 ℃条件下，水浴振荡提取45 min。其他步骤同（1），研究不同乙醇浓度对仙人掌果多酚提取效果的影响。

1.2.5 正交试验

在单因素试验基础上，以提取温度、提取时间、料液比、乙醇浓度为因素，以多酚得率为评价指标，设计L9(34)正交试验，确定仙人掌果多酚的最佳提取工艺，因素水平设计见表1。

表1 仙人掌果多酚提取工艺的正交试验设计Table 1 Orthogonal test design of extraction process of polyphenols from cactus fruit

1.2.6 仙人掌果多酚提取物抗氧化活性评价

DPPH 自由基于醇溶液中呈现深紫色，在517 nm 处显示特征吸收峰，抗氧化剂可结合其单电子，吸光度减弱，清除程度与抗氧化剂能力呈剂量依赖关系[10]。取适当浓度的仙人掌果多酚溶液2 mL，与2 mL DPPH 溶液（400 μmol/L），30 ℃暗室条件下反应30 min，以甲醇为空白，测定517 nm 处的吸光度，计算清除率（公式1）及IC50值（公式2）。

式中：A1为2 mL 样品液+2 mL DPPH 溶液在517 nm 下的吸光度；A2为2 mL 去离子水+2 mL DPPH 溶液在517 nm 下的吸光度；A3为2 mL 去离子水+2 mL 样品液在517 nm 下的吸光度；A4为2 mL 去离子水+2 mL 甲醇在517 nm 下的吸光度。

式中：S为半数清除率（50）。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

利用Folin-Ciocalteus 法，以吸光度A对浓度C（μg/mL）进行线性分析，得到没食子酸标准曲线（见图1），回归方程为A=0.044c+0.027 6（R2=0.999 1）。

2.2 仙人掌果多酚提取单因素试验

2.2.1 提取温度对仙人掌果多酚得率的影响

图2 显示了提取温度对多酚得率的影响。由图可知，提取温度低于40 ℃时，随着温度的升高，多酚得率不断提高；超过40 ℃后，多酚得率逐渐下降，70 ℃时略有回升；在40 ℃时，多酚得率最高，为0.40%±0.02%。这可能是由于随着体系温度的升高，植物多酚在溶剂体系中的溶解度以及扩散系数均会随之增大，这有利于溶质的浸提溶出。然而当体系温度过高，则会导致部分多酚氧化修饰或分解，另外高温溶剂易挥发，这影响了溶质在体系中的分散度[11]，从而降低了多酚的提取得率。故选择40 ℃为最适提取温度。

2.2.2 提取时间对仙人掌果多酚得率的影响

图3 显示了提取时间对多酚得率的影响。由图3 可知，随着提取时间的延长，仙人掌果多酚得率先升后降之后又上升，提取时间为30 min 时，多酚得率最高，为0.34%±0.02%。随着提取时间的延长，多酚提取得率随之提高，可能由于与溶剂体系充分接触，利于内容物由细胞内溶出释放，时间延长，溶出达到饱和；另外提取时间过长，其他杂质与目标内容物构成竞争，可能影响目标内容物的选择性溶出[12]。故选择30 min 为最佳提取时间。

2.2.3 料液比对仙人掌果多酚得率的影响

图4 显示了料液比对多酚得率的影响。由图可知，随着溶剂量的增加，多酚得率呈现先上升后略下降的趋势；在料液比1:40 时，多酚得率最高，为0.36%，可能由于水醇体系可促使多酚类物质与蛋白质、多糖等大分子化合物之间氢键的断裂[13]，在一定范围内增加溶剂用量，利于多酚类物质溶出，继续降低料液比，溶出达到饱和，得率增加不明显或有所下降。故选择1:40 为最适料液比。

2.2.4 乙醇浓度对仙人掌果多酚得率的影响

图5 显示了乙醇浓度对多酚得率的影响。由图5 可知，多酚得率随着乙醇浓度的提高总体呈现先降后升再下降的趋势。在乙醇浓度为60%时，多酚得率最高，为0.31%±0.02%。可能由于极性相似相溶，一定乙醇浓度范围，醇水体系利于多酚成分溶出，乙醇浓度过高，醇解反应产生的醇溶性杂质的溶出量增加[14]，并与多酚类化合物形成竞争，导致多酚得率下降。故选择60%为最适乙醇提取浓度。

2.3 仙人掌果多酚提取的正交试验

由表2 极差分析可知，各因素对多酚得率影响依次为D>A>B>C，乙醇浓度为最主要的影响因素；理论最佳工艺为A3B3C3D2。对比验证理论最佳组合（A3B3C3D2）与表观最优组合（A3B1C3D2）如表3 所示，由表3 可知，多酚得率分别为0.37%±0.01%与0.40%±0.02%，A3B3C3D2高于A3B1C3D2。综上考察，最佳提取工艺条件为提取温度50 ℃，提取时间45 min，料液比1:50（g/mL），乙醇浓度60%。

表2 仙人掌果多酚提取最佳工艺正交试验Table 2 Orthogonal test of best extraction process of polyphenols from cactus fruit

表3 验证试验结果Table 3 Results of verification experiment

2.4 仙人掌果多酚提取物的抗氧化活性评价

目前关于天然产物抗氧化活性评价有自由基清除、脂质过氧化、抗氧化酶活性、DNA氧化损伤等方法[15]。DPPH作为以氮为中心的稳定自由基，由于结构简单、反应过程易控制，已被广泛应用于单一化合物及提取物的抗氧化活性评价与筛选[16]。在乙醇浓度60%，料液比1:50（g/mL），提取温度50 ℃，提取时间45 min 的工艺条件下，提取制备仙人掌果总多酚，并进行DPPH 自由基清除率测定，结果如图6 所示。

由图6 可知，仙人掌果多酚提取物对DPPH 自由基有较强的清除效果，且随着浓度的增加而增大，清除率（%）与质量浓度（mg/mL）呈线性关系（y=27.587x+0.191 2，R2=0.998 9），IC50为1.81 mg/mL。

3 结论

本研究以乙醇为提取溶剂，采用单因素及正交试验对仙人掌果多酚的提取工艺进行了优化，结果发现，各因素对仙人掌果多酚类物质提取得率影响的主次顺序为乙醇浓度>提取温度>提取时间>料液比；最佳提取条件为乙醇浓度60%，料液比1:50（g/mL），提取温度50 ℃，提取时间45 min，在此条件下仙人掌果多酚得率为0.40%±0.02%，仙人掌果多酚提取物显示出了较强的DPPH 自由基清除能力，IC50值为1.81 mg/mL。