两种复合免疫增强剂对黄鳝生长、免疫及生理生化指标的影响

■车常宝 石 勇 胡 毅 钟 蕾

（湖南农业大学动物科学技术学院湖南省特色水产资源利用工程技术研究中心，湖南长沙410128）

穿心莲内酯（Andrographolide），是从爵床科草本穿心莲[Andrographis panicultata（Burm.f）]全草中提取的主要有效成分[1]，Zhou等[2]、Lee等[3]和Wong等[4]表明穿心莲内酯具有治疗病毒感染、抗炎和抗癌作用。给每千克鱼体投喂10～30 mg/d 黄芪多糖可增强草鱼（Ctenopharyngodon idella）[5]非特异性免疫功能。在饲料中添加1 g/kg三丁酸甘油酯[6]、0.4%甘露寡糖[7]能分别促进建鲤（Cyprinus carpiovar Jian）、鳗鲡（Anguilla anguilla）生长、增强肠道消化酶活性和提高鱼体非特异性免疫力；适宜剂量的胆汁酸、牛磺酸能提高水产动物氧化能力，调节牛蛙（Ranacatesbeiana）[8]肝脏脂类代谢水平，减轻鲤鱼（Cyprinus carpio）[9]的脂质过氧化作用。有关研究显示，投喂由甘露聚糖、β-葡聚糖组成的复合免疫增强剂相比单独投喂能进一步提高刺参（Apostichopus japonicus）[10]的生长率、非特异性免疫酶活性，且其持续时间更长；0.2%黄芪多糖、人参茎叶皂苷、绿原酸、生物碱和黄酮等5 种配比的复方中草药免疫增强剂能够提高鲤鱼[11]增重率和降低饲料系数，促进鲤鱼的生长和提高鱼体非特异性免疫。

黄鳝(Monopterus albus)，亦称鳝鱼，目前我国黄鳝养殖产量已达30万吨[12]，产值超过210亿元。近年来我国养殖量不断加大，使得疾病状况日趋严重，同时抗生素的大量使用使得黄鳝抗病力下降，给养殖户造成严重的损失[13]。

本试验利用不同免疫增强剂之间的协同作用，通过合理的配比，有选择性的将几种免疫增强剂搭配使用，旨在研究以穿心莲内酯为主的黄鳝水产复合免疫增强剂，替代抗生素，促进鱼类生长，增强鱼体免疫力，提高鱼类抗病、防病能力和抗逆性，以期为水产动物免疫增强类添加剂替代抗生素的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

穿心莲内酯（纯度98%，购于湖南佳瑞思生物科技有限公司）、三丁酸甘油酯（购于青岛柯能生物科技有限公司）、胆汁酸（购于山东龙昌动物科技有限公司）、甘露寡糖（购于青岛玛斯特生物技术有限公司）、黄芪多糖（购于四川省环亚生物科技有限公司）、牛磺酸（购于源叶生物科技有限公司）。

1.2 试验饲料

以黄鳝商品饲料为基础，配制出一种以鱼粉、豆粕、玉米蛋白粉和大豆浓缩蛋白为蛋白源，鱼油为脂肪源的基础饲料，试验饲料组成及营养水平见表1。复配1（F1，基础饲料+0.05%穿心莲内酯+三丁酸甘油酯0.05%+胆汁酸0.02%+甘露寡糖0.04%）、复配2（F2，基础饲料+0.05%穿心莲内酯+三丁酸甘油酯0.05%+黄芪多糖0.05%+牛磺酸0.02%）。饲料原料经先粉碎过60 目筛网，再按配比从小到大逐级定量均匀混合，再将其进入V 型搅拌机充分混合25 min，随后将鱼油与已混好的干粉充分混匀，饲料风干后置于-20 ℃冰箱中保存备用，投喂前加20%水调成面团状使用。

1.3 饲养与管理

养殖试验在湖南省常德市西湖镇黄鳝实验基地进行，通过池塘网箱养殖方式进行试验，放入网箱后停食48 h，用蚯蚓和鱼浆进行前期驯化，驯养到能够正常摄食全鱼浆。后期驯化投喂饲料与鱼浆混合物(比例1∶4)，根据摄食情况提高饲料的比例，直至黄鳝完全摄食饲料，整个驯化时间约为15 d，停食24 h后，挑选初始体重为(25.00±0.05) g 的黄鳝随机分成3 组，每组3个重复，共9个网箱(1.5 m×2.0 m×1.0 m)，每个网箱饲养60 尾黄鳝。日投喂1 次(17:00～18:00)，投喂量为黄鳝体重的3%～5%，每星期调整一次投喂量，养殖时间持续56 d。

1.4 样品采集

养殖56 d后，禁食24 h，分别取出各网箱的黄鳝，称量总重并记录尾数，每个网箱采集5 尾鱼，用2 ml注射器尾静脉取血，将血液混合并置于无菌离心管中，4 ℃静置过夜，3 000 r/min 离心10 min，取上层血清置于-80 ℃冰箱保存备用；取鱼体肝脏保存于-80 ℃冰箱备用；分别取鱼体肝脏、肠道组织于1.5 ml无RNA酶管中，封口膜封口后置于液氮中，-80 ℃保存备用。

表1 基础饲料组成及营养水平（风干基础，%）

1.5 指标测定方法

1.5.1 生长指标

试验起始和结束时分别对各网箱黄鳝进行计数和称重计算特定生长率、增重率、成活率和饵料系数。

特定生长率(SGR，%/d)=（lnW2-lnW1）×100/t

增重率(WGR，%)=(W2-W1)/W1×100

存活率(SR，%)=(N1-N2)/N1×100

饵料系数（FCR）=F/（W2-W1）

式中：W1——试验开始时黄鳝总重(g)；

W2——试验结束时黄鳝总重(g)；

t——饲养天数(d)；

F——饵料摄入量(g)；

N1——试验鱼初始尾数；

N2——试验鱼结束尾数。

试验结束后每网箱随机取5尾黄鳝，记录体长和体重，解剖取内脏并分离肝脏称重，计算肝体比、脏体比和肥满度。

肝体比（HSI，%）=肝脏重/体重×100

脏体比（VSI，%）=内脏重/体重×100

肥满度（CF，%）=体重（g）/[体长（mm）]3×100

1.5.2 体成分

试验结束后，每个网箱随机取5尾黄鳝用于体成分检测。其中水分含量的测定采用105 ℃烘箱干燥恒重法，粗蛋白含量的测定采用凯氏定氮法，粗脂肪含量的测定采取索氏抽提法，粗灰分含量的测定采用550 ℃灼烧法。

1.5.3 酶活性指标

血清中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)、葡萄糖（GLU）、总胆汁酸（TBA）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）以及肠道脂肪酶、胰蛋白酶、淀粉酶按照从南京建成生物工程研究所订购的试剂盒的要求进行检测；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)以及肝脏中谷胱甘肽（GSH）、总抗氧化能力（TAOC）按照从南京建成生物工程研究所订购的试剂盒的要求进行检测；血清免疫球蛋白M(IgM)、补体4(C4)指标按照从浙江伊利康生物技术有限公司订购的试剂盒的要求进行检测。

1.6 数据处理与分析

采用SPSS20.0对试验数据做统计分析，试验结果用“平均值±标准误”（mean±SE）表示，先对数据做单因素方差分析（One-way ANOVA），若组间差异显著，再用Duncan's法多重比较，显著性水平为0.05。

2 结果

2.1 复合免疫增强剂对黄鳝生长性能的影响(见表2)

表2 复合免疫增强剂对黄鳝生长性能的影响

由表2可知，F1、F2组的饵料系数显著低于F0组（P＜0.05），而增重率、特定生长率则与之相反；各组肝体比、脏体比、肥满度均低于F0 组，但与F0 组相比无显著差异（P＞0.05）；在复配组之间，F1组的增重率、特定生长率、肝体比、脏体比最高，F2 组次之，而存活率、肥满度与之相反。

2.2 复合免疫增强剂对黄鳝肠道消化酶活性的影响（见表3）

表3 复合免疫增强剂对黄鳝肠道消化酶活性的影响

由表3 可知，F1、F2 组黄鳝肠道胰蛋白酶活性显著高于F0 组，但F1、F2 组之间差异不显著。与F0 组相比，F2组淀粉酶活性显著高于F0组（P＜0.05），F1组与F0、F2组差异不显著（P＞0.05）；F1组脂肪酶活性显著高于F0 组（P＜0.05），但F2 组与F0 组无显著差异（P＞0.05）。

2.3 复合免疫增强剂对黄鳝体成分的影响（见表4）

表4 复合免疫增强剂对黄鳝体成分的影响(%)

由表4 可知，各组黄鳝粗灰分含量无显著影响（P＞0.05）。与F0 组相比，F1 组和F2 组粗蛋白含量显著升高（P＜0.05）；F1组粗脂肪含量显著低于F0组（P＜0.05），但F2组与F0组无显著差异（P＞0.05）。

2.4 复合免疫增强剂对黄鳝血清免疫相关酶活性的影响（见表5）

表5 复合免疫增强剂对黄鳝血清免疫相关酶活性的影响

由表5 可知，各组黄鳝血清中IgM 含量无显著影响（P＞0.05）。与F0 组相比，F1 组和F2 组血清中SOD活性显著升高（P＜0.05），MDA 含量显著降低（P＜0.05）；F1组血清中CAT活性显著升高（P＜0.05），C4含量和AKP 活性显著降低（P＜0.05），F2 组与F0 组无显著差异（P＞0.05）。

2.5 复合免疫增强剂对黄鳝肝脏抗氧化能力的影响（见表6）

由表6可知，各组黄鳝肝脏CAT含量无显著影响（P＞0.05）。与F0组相比，F1组和F2组GSH含量显著升高（P＜0.05），MDA 含量显著降低（P＜0.05）；F1 组肝脏SOD活性显著升高（P＜0.05），T-AOC含量显著降低（P＜0.05），F2组与F0组无显著差异（P＞0.05）。

表6 复合免疫增强剂对黄鳝肝脏抗氧化能力的影响

2.6 复合免疫增强剂对黄鳝血清生化指标的影响（见表7）

表7 复合免疫增强剂对黄鳝血清生化指标的影响

由表7可知，各组黄鳝血清AST活性、GLU、TBA、TC 含量无显著影响（P＞0.05）。与F0 组相比，F1 组和F2 组ALT 活性、LDL 含量显著降低（P＜0.05）；F1 组血清HDL含量显著低于F0组（P＜0.05），F2组与F0组无显著差异（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 两种复合免疫增强剂对黄鳝生长性能的影响

本研究中，黄鳝基础饲料中添加以穿心莲内酯为主的复合免疫增强剂均能提高黄鳝增重率、特定生长率、肠道消化酶活性，降低饵料系数，提高黄鳝生长性能。这与翟秋玲等[14]在菊黄东方鲀基础饲料中添加50 mg/kg 三丁酸甘油酯+250 mg/kg 甘露寡糖可维护菊黄东方鲀的肠道健康，增强肠道消化酶活力，提高饲料效率和生长性能；Bo Liu 等[15]研究表明甘露寡糖可以提高异育银鲫的存活率、生长性能；牛志伟[16]通过Meta 分析法表明甘露寡糖具有提高鱼类、南美白对虾、海参的增重率和特定增长率，可以显著降低鱼类的饵料系数；杜宗君等[17]研究表明在饲料中添加200、400 mg/kg 甘露寡糖，可显著提高泥鳅的特定生长率和肥满度，降低了饵料系数，促进泥鳅的生长研究相似。同时，在唐启峰等[18]、Hou 等[19]的研究中发现，三丁酸甘油酯均能提高养殖动物的生长性能。同时，本试验中F1、F2组粗脂肪均低于F0组，粗蛋白均高于F0 组，表明以上两种复合免疫增强剂均能提高蛋白质的利用以及促进脂肪的消化吸收。由表2、表3、表4可知，在提高生长性能方面，F1组效果更好，这可能是由于F1 组免疫增强剂的协同效果更优于F2 组，也有可能是前者添加的单一免疫增强剂配比更佳。

3.2 两种复合免疫增强剂对黄鳝血清、肝脏生化及免疫功能的影响

AST是一种重要的氨基转移酶，活性的变化也是反映肝细胞受到损伤的主要敏感指标。正常情况下，动物的血清中只含有微量的AST，当血清中AST的活性升高或组织内AST的活性降低时，即表明动物机体的肝脏、心脏等内脏器官发生损伤[20]。ALT 广泛存在于动物机体内，是机体内中间代谢的重要反应酶，在机体蛋白质代谢中起主要作用，其活性也是反映肝细胞受损伤的重要指标。本试验中，F1、F2组AST 活力略低于F0组，而ALT活力则显著低于F0组，且复配组之间AST、ALT 活力差异不显著，以上表明添加的两种复合免疫增强剂均可保护肝细胞不受损害，增强对机体的保护功能。血清TC可反映机体脂肪代谢的总体情况。本试验中，FI、F2组复合免疫增强剂较F0组有降低血清TC 含量的能力。有研究表明，一定剂量的果寡糖可降低异育银鲫的血清胆固醇和甘油三脂的含量[21]；在饲料中添加果寡糖和甘露寡糖，降低了大菱鲆幼鱼血清总胆固醇和甘油三酯含量[22]，以上研究与本试验结果类似，同时，复配组黄鳝鱼体粗脂肪含量、血清LDL含量均低于F0组，表明甘露寡糖可通过降低鱼体血清TC、LDL 含量、鱼体粗脂肪来调节脂类代谢，寡糖具有调节动物血清中生化指标和改善动物健康状况的功能。

AKP是鱼类代谢过程中重要的调控酶，可以催化磷酸单酯的水解及磷酸基团的转移反应，对机体非特异性免疫也发挥着重要作用，AKP活性的高低可以用来判断鱼类非特异性免疫机能的强弱[23]。免疫球蛋白因其具有结合抗原、激活补体和调节机体免疫等生物学功能，且能够反映出机体的免疫水平，甚至能够直观地反映免疫组织器官的形态结构及功能的变化[24]。本试验中，F2 组AKP 含量略低于F0 组，F1组显著低于F0 组，这与徐磊等[25]研究表明连续投喂240、480 mg/kg甘露寡糖组能显著提高异育银鲫AKP活性的实验结果不同，这可能是同种免疫增强剂添加对象、添加剂量或者复配形式不同，其使用效果也有一定差异。

SOD在抗氧化酶系统中起防御作用，可催化超氧阴离子自由基的歧化反应；MDA 是脂质过氧化反应链终止阶段产生的小分子物质，它的变化趋势可以间接反映动物机体的抗氧化能力强弱；T-AOC反映机体对外来刺激的抵抗能力及体内自由基代谢状态，它是反映动物机体氧化应激的典型指标[26]。有研究表明，穿心莲内酯在外周组织中具有抗炎和抗氧化活性[27]，可降低CNS 中氧化应激[28]，也可能通过上调Nrf2，一种抗氧化反应的主调节因子，对原代星形胶质细胞具有抗氧化作用[29]。本试验发现在基础饲料中添加以穿心莲内酯为主不同配比的免疫增强剂均能提高黄鳝的血清非特异性免疫能力，表现为F1、F2组黄鳝血清SOD 活性均显著高于F0 组以及MDA 含量显著低于F0 组。Sani 等[30]研究表明穿心莲内酯下调促炎细胞因子和自由基产生，艾春汉等[31]研究表明将穿心莲浸膏粉添加到罗非鱼饲料中，可显著降低其肝脏中MDA含量，并显著提高其血清中SOD活力，本试验结果与上述研究结果一致，这表明穿心莲内酯可增强黄鳝机体免疫力。F1 组黄鳝血清、肝脏SOD 活力、CAT含量均高于F0组，与于朝磊等[32]发现甘露寡糖可显著提高半滑舌鳎稚鱼的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力研究结果一致，这可能是甘露寡糖与动物肠道的病原菌（如大肠杆菌、沙门氏菌、梭状芽抱杆菌等）特异性结合，减少其与动物肠道黏膜上皮细胞结合的机会，从而起到竞争抑制的双重营养免疫作用。黄芪多糖具有提高SOD的表达，降低MAD的含量的作用，具有很强抗氧化活力[33]，在尼罗罗非鱼[34]、黄颡鱼[35]的基础饲料中添加不同水平的黄芪多糖可以提高鱼体超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性并有效地提高鱼体的抗氧化能力，以上实验研究与本试验结果类似，这表明几种免疫增强剂合理配比能够明显提高黄鳝机体抗氧化能力，有利于提高鱼体抗病力。

另外，穿心莲内酯+三丁酸甘油酯+胆汁酸+甘露寡糖、穿心莲内酯+三丁酸甘油酯+黄芪多糖+牛磺酸对投喂黄鳝生长和抗氧化能力的影响表现出高度的一致性，因此，以上复合免疫增强剂投喂黄鳝对其抗氧化能力的提高，在一定程度上促进了机体免疫机能的改变，继而提高了黄鳝机体抗病力，可能是促进其生长的一个重要原因，但各组分在提高黄鳝非特异性免疫力过程中的作用及交互作用机制还需要进一步研究。

4 结论

免疫增强剂能提高水产动物生长性能，又能提高水产动物的免疫力和抗病力的优点，可以作为预防水产动物疾病暴发的好产品。在本试验条件下，饲料中添加以穿心莲内酯为主的复合免疫增强剂能够促进黄鳝生长性能、增强机体免疫力，其中F1 组效果更好，F2组次之，但各组分在提高黄鳝非特异性免疫力过程中的交互作用机制还需要进一步研究。