手足口病毒和白细胞分类的探讨*

谢兴凤，蒋久怡，任艳，张旭

（1.绵阳市中心医院 检验科，四川 绵阳 621000；2.四川绵阳四〇四医院 检验科，四川 绵阳621000）

手足口病是世界范围内流行的儿童常见病,多发生于婴幼儿时期，发病率和病死率曾位于丙级传染病首位，在世界范围内引起12 次爆发式流行，我国多省份出现流行性传播。该病主要通过人群密切接触传播，以发热和疱疹为主要临床表现，部分患者伴有咳嗽、流涕、食欲不振、恶心、呕吐和头疼等症状。手足口病为自限性疾病，极少数重症患者可出现脑炎、急性迟缓性麻痹、脑水肿、心肌炎等严重并发症，且病情进展快，病死率高[1-2]。

肠道病毒是手足口病的常见病原体，已知20 多种血清型，常见的有柯莎奇病毒A 组16、4、5、9、10 型，B 组2、5 型，以及肠道病毒71 型，尤其以柯莎奇病毒A16 型（coxsachie virus 16,CVA16）和肠道病毒71 型（human enterovirus 71,EV71）最为常见。EV71 的致病力极强，常常在感染人体后，进而感染人的神经系统，引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹等多种神经系统疾病[3]。机体感染后虽可获得相应免疫力，但由于病原体的血清型多样，亦可反复性感染发病。因此，早发现、早报告、早诊断和早治疗对手足口病的预防监控有着重要意义。本文主要针对手足口病毒CAV16 和EV71 与血常规指标进行分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年4月—2018年7月四川绵阳四〇四医院诊断为手足口病患儿7 342 例。同时收集EV71阳性或CVA16 阳性患儿患病期间血常规中白细胞（WBC）、中性粒细胞（N）、淋巴细胞（L）和单核细胞（M）的检测结果。

1.2 仪器与试剂

日立7600-020 全自动生化分析仪及配套试剂（日本日立公司），Abx Pentra DF 120 血常规检测仪（法国Horiba ABX 公司），EV71、CVA16 及通用型肠道病毒检测试剂盒（江苏默乐生物科技股份有限公司），ABI 7500 PCR 扩增仪（美国ABI 公司）。

1.3分组

将CVA16 阳性结果患儿1 562 例作为CVA16 组，EV71 阳性结果患儿602 例作为EV71 组，健康体检者125 例作为正常组。另将WBC、L、N 和M分为降低组、正常组、升高组和极高组，正常组血常规指标为临床的正常值范围。

1.4 方法

①标本采集：手足口病患儿发病期间，使用专门采样棉签涂抹患儿两侧扁桃体和咽喉壁部位，避免接触舌头，采样后立即将棉签置于专门的保存液中，密封采样管送检，若不能及时检测则置于-20℃冰箱冷冻保存。②采用胍盐裂解的柱式离心法从样本中提取病毒RNA，采用聚合酶链反应（PCR）结合Taqman荧光探针对咽拭子样本中C4 亚型EV71 型、CVA16型及其他型（如CVA2、4、5、7、9、10 和CB1、2、3、4、5 等）肠道病毒进行鉴别检测。③收集手足口病患儿发病期间血WBC、N、L 和M 的检测结果。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用方差分析；计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验，采用受试者工作特征（ROC）曲线分析各指标的诊断价值，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本资料分析结果

共得样本7 342 例，其中EV71 阳性602 例，阳性率8.20%；CVA16 阳性1 562 例，阳性率21.27%；通用肠道病毒型阳性4 036 例，阳性率54.97%；其他型阳性1 142 例，占15.55%。EV71 和CVA16 同时阳性者无。2 种病毒检出人数男性高于女性，以幼儿阶段（1～3 岁）检出人数最多，学龄前阶段（＞3～6 岁）次之，但各年龄段的检出率比较，差异有统计学意义（χ2=29.718，P=0.000）。见表1。

2.2 WBC、L、N 和M 检测结果比较

CVA16 组、EV71 组及正常组中WBC、N、L 和M比较，差异有统计学意义（P＜0.05），CVA16 组和EV71组WBC、L 和M 高于正常组（P＜0.05），N 低于正常组（P＜0.05）。CVA16组的各项检测指标也稍高于EV71组，但只有M 在两组间的差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 各年龄阶段EV71 和CVA16 检出率的比较 例（%）

2.3 CVA16 和EV71 在WBC、L、N 和M 各组中的分布

在WBC、L 和N 各组中，均是正常组和升高组CVA16 和EV71 例数最多，两组例数总占比较高（WBC：91.87%，94.02%；L：81.82%，83.22%；N：84.90%，90.53%），其中正常组例数占比高于升高组。在M分组中，正常组和升高组CVA16 和EV71 例数最多，两组例数总占比分别为91.48%和94.69%，但CVA16 和EV71 在升高组中的例数占比高于正常组。见表3～6。

2.4 WBC、L、N 和M 诊断CVA16 和EV71 的ROC 曲线分析

WBC、L、N 和M 诊断EV71 的ROC 曲线分析显示，L 和M 的AUC分别为0.865（95% CI：0.832，0.897）和0.617（95% CI：0.571，0.662），敏感性和特异性分别为73.42%（95% CI：69.7，76.9）、96.55%（95% CI：82.2，99.9）和48.50%（95% CI：44.5，52.7）、93.10%（95% CI：77.2，99.2），WBC 和N 的AUC＜0.5。见图1。WBC、L、N 和M 诊断CVA16 的ROC 曲线结果显示，WBC、L 和M 的AUC分别为0.521（95% CI：0.486，0.556）、0.865（95% CI：0.840，0.889）和0.672（95% CI：0.639，0.705），敏感性和特异性分别为：38.86%（95% CI：36.4，41.3）、96.55%（95% CI：82.2，99.9），75.22%（95% CI：73.0，77.3）、96.55%（95% CI：82.2，99.9），54.74%（95% CI：52.2，57.2）、93.10%（95% CI：77.2，99.2）。见图2。如图3 所示，WBC、L、N 和M 诊断CVA16 和EV71 的ROC 曲线结果显示，WBC、L、N 和M 的AUC分别为0.525（95% CI：0.498，0.552）、0.522（95% CI：0.495，0.549）、0.505（95% CI：0.479，0.531）和0.561（95% CI：0.535，0.588），两者间鉴别诊断价值不高。

表2 各组WBC、L、N 和M 的比较（×109/L，±s）

表2 各组WBC、L、N 和M 的比较（×109/L，±s）

注：①与正常组比较，P ＜0.05；②与EV71 组比较，P ＜0.05。

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表4 不同L 患者CVA16 和EV71 的分布 例（%）

表5 不同N 患者CVA16 和EV71 的分布 例（%）

表6 不同M 患者CVA16 和EV71 的分布 例（%）

图1 WBC、L、N 和M 诊断EV71 的ROC 曲线

图2 WBC、L、N 和M 诊断CVA16 的ROC 曲线

图3 WBC、L、N 和M 诊断CVA16 和EV71的ROC 曲线

3 讨论

手足口病是一种较温和的以手足皮肤和口腔黏膜疱疹为主要症状的小儿急性传染病，近年来呈上升趋势，严重威胁儿童的健康[4]。诱发手足口病的病毒均属于微小核糖核酸病毒科、人肠道病毒属，其血清型多种多样，肠道病毒中的EV71 和CVA16 是其主要的型别[5]，CVA6 和CVA10 亦有升高的趋势。手足口病的发病机制为病毒与咽部及肠道上皮细胞表面的受体结合后，通过细胞内吞作用进入细胞内进行复制再释放入血，随血流运行引起各组织病变，EV71 和CVA16 的主要病毒受体为人类清道夫受体B2 和P-选择素糖蛋白配体-1[6]。有关手足口危险因素的分析认为，虽然众多研究表明EV71 感染与引发手足口病例死亡密切相关[7]，但CVA 组中的型别诱发手足口病例死亡的风险也不可忽视[8]。目前，EV71 病毒疫苗已经可以接种，但在我国接种此疫苗并未被广泛普及，且各病毒型别间无交叉免疫力，疫苗接种无法预防其他型别血清型病毒的感染[9]。因此，手足口病的的防治依然是重中之重。

近年来，有关手足口病的研究多侧重于诊断方向，选择的指标有WBC、超敏CRP、PCT、血糖[10]、心肌酶谱、脑钠肽[11]、免疫球蛋白[12]、淋巴细胞亚群等[13]，研究其单独或者联合诊断手足口病的敏感新和特异性。病毒感染时，机体产生免疫应答过程，WBC 是重要的应答细胞，其总数会增加，正常比例下，WBC分类中各类细胞数也会有所增加。血常规是每个患者首查和必查项目，结果报告快，可为疾病诊断提供重要基础信息。本文重点分析WBC 总数及分类中的N、L 和M 数与EV71 和CVA16 两型手足口病的关系，以求找到新的辅助诊断指标以鉴别诊断EV71 与CVA16 型手足口病。本研究中，EV71 阳性602 例，阳性率8.20%；CVA16 阳性1 562 例，阳性率21.27%；通用肠道病毒型阳性4 036 例，阳性率54.97%；其他型阳性1 142 例，占15.55%。EV71 和CVA16 同时阳性者无。2 种病毒检出人数男性高于女性，以幼儿阶段（1～3 岁）检出人数最多，学龄前阶段（＞3～6 岁）次之，各年龄段2 种病毒的检出率有差异。N 是WBC分类中占比最多的细胞，在病毒感染时，其发生炎症反应，数量可能正常或增加，细胞形态会发生空泡变性、退化中毒颗粒等变化，本文血常规WBC分类和计数显示，各组比较，WBC、L、N和M 的差异有统计学意义，CVA16 组和EV71 组WBC、L 和M 高于正常组，仅N 低于正常组。WBC 与L 的结果与简翠凤[14]的报道结果相符合。CVA16 的各项检测指标也稍高于EV71 组，但只有M 在两组间的比较差异有统计学意义。病毒感染以体液免疫应答为主，L 中的T、B 淋巴细胞参与免疫应答，患儿的相应细胞分类应低于同龄患儿，本文结果有所不符，但有报道称随着手足口病程进展L 呈逐渐上升趋势，因此本文结果统计时未分病程阶段，数据可能来自于病程后期。下一步可对病程中L 的动态监测进行分析。M 是巨噬细胞的前身，病毒感染时，可吞噬异物，并将其传递给淋巴细胞，诱导L 的特异性免疫反应，因此，在病毒感染时，M 会反应性增加，本结果提示M 或可能作为预测EV71和CVA16 型感染的辅助鉴别指标。将WBC、L、N 和M分为降低组、正常组、升高组和极高组，在WBC、L和N 各组中，均是正常组和升高组CVA16 和EV71 例数最多，且正常组稍高于升高组。说明当WBC、L 和N 的计数值多数在正常范围内或轻微升高时，亦不能排除EV71 和CVA16 感染。唯独M 各组中，升高组中CVA16 和EV71 的例数多于正常组，提示M 升高时，EV71 和CVA16 感染的可能性大。ROC 曲线结果显示，L 预测EV71 和CVA16 的AUC 和95%CI分别 为0.865（0.832，0.897）和0.865（0.840，0.889），特异性（＞90%）和敏感性（＞70%）较高，AUC 在0.7～0.9，说明L 用于预测是否有感染EV71 和CVA16 型病毒有较高的价值。M预测EV71 和CVA16 的AUC 为0.617 和0.672，特异性较高，达到90%，但敏感性较低，低于60%，虽然显示有一定的诊断价值，但准确性不高。其余指标的AUC 均较小，未显示其实验价值，但也可能是本实验中阴性对照的病例数选择较少，结论的准确性有待增加病例进一步探讨。CVA16 与EV71（以CVA16 为阳性事件）的ROC 曲线结果显示，WBC、L、N 和M的AUC分别为0.525、0.522、0.505 和0.561，显示鉴别诊断CVA16 和EV71 的价值不高。

综上所述，本实验结果显示WBC、L、M 和N 对是否感染CVA16 与EV71 型病毒有一定预测价值，其中以L 的预测结果准确性最高，M 次之。在CVA16和EV71 型间，M 的预测效果稍高于其他指标，但准确性依然未达到临床应用要求。本实验组间病例数相差较大，对结果可能有一定的影响，因此，本实验结论有待调整病例数，做进一步分析研究。