皮肤恶性黑色素瘤患者Cx43表达水平及预后影响因素分析

王峻岭 李 慧 张冀北 张 丽 刘芳芳

皮肤恶性黑色素瘤是一种恶性程度较高的恶性肿瘤，近年来发病率呈明显升高趋势，年增长率约为3%～5%[1]；手术切除是其首选的治疗方法，但患者术后生存状况普遍不乐观，此病的发病机制目前仍未完全阐明。缝隙连接蛋白(connexin，Cx)是一种跨膜蛋白家族，目前该家族在人类体内共发现有20余个成员，其中Cx43最常见，并在体内广泛表达，主要参与细胞的缝隙连接通讯，近年来发现其与多个恶性肿瘤的发生、发展密切相关[2-3]。有体外研究[4-5]表明Cx43在皮肤恶性黑色素瘤中可能作为肿瘤抑制因子，过表达野生型Cx43能明显增强小鼠黑色素瘤细胞的缝隙连接通讯功能，而过表达突变型Cx43则能减弱该功能，但国内尚未见Cx43在皮肤恶性黑色素瘤患者体内研究的报道。本研究检测56例皮肤恶性黑色素瘤患者的癌组织与癌旁组织Cx43表达水平，旨在探讨影响患者预后的因素，为临床预后评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月至2016年12月河北省沧州市中心医院收治的56例皮肤恶性黑色素瘤患者为研究对象，其中男35例，女21例，年龄35～75岁，平均(55.75±5.33)岁。纳入标准：①首次发病，入院后均行手术治疗，病理结果确诊为皮肤恶性黑色素瘤；②预期寿命超过3个月；③术前未接受任何抗肿瘤治疗；④临床及病理资料完整。排除标准：①年龄>75岁；②合并其他恶性肿瘤或心、肝、肺、肾等脏器严重疾病。

1.2 方法 检测并比较患者癌组织与癌旁组织的Cx43表达水平，以全部患者癌组织Cx43表达水平的中位数0.85为临界值，将患者分为低表达组和高表达组，各28例。收集患者病例资料，比较两组临床病理特征和生存状况，采用多因素Cox回归模型分析患者预后的影响因素。

1.2.1 Cx43表达水平的检测 采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)方法检测所有患者癌组织和癌旁组织的Cx43表达水平：术中取直径约10 mm的组织样本，放至-80℃冰箱保存，采用专门的RNA 提取试剂盒(北京天根生物公司)提取组织的总RNA，全部过程严格按照说明书进行，用焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水溶解提取的总RNA，采用紫外分光光度计(德国Eppendorf公司)测量RNA的浓度与纯度，之后采用专门的逆转录试剂盒(上海TaKaRa公司)将RNA逆转录为cDNA，反应体系为10 μL，包括模板4 μL、5×Prime Script Buffer 2 μL、DEPC水4 μL，反应条件为：37℃ 5 min→85℃ 5 s→4℃ 10 min。然后采用q-PCR检测Cx43的表达水平，通过Primer Bank软件设计相关引物(上海生工生物公司)。Cx43引物序列：上游，5’-TTCAAGCCTACTCAACTGC-3’，下游，5’-CTTCCTTTCGCATCACAT-3’。反应体系为20 μL，包括模板4 μL、TB Green Premix Ex TaqⅡ 2 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DEPC 水12 μL，反应条件为：95℃ 5 min→95℃ 5 s→60℃ 34 s，循环40次。以GAPDH表达水平为内参，根据2-△△Ct法[6]计算 Cx43的相对表达量。

1.2.2 资料收集 收集并记录全部患者的病例资料，包括性别、年龄、体质指数(body mass index，BMI)、卡氏评分、发病部位、原发灶的厚度、有无溃疡、原发灶-淋巴结-远处转移(tumor-node-metastasis,TNM)分期、Clark分级、治疗方法等。术后通过电话、门诊进行定期随访，随访截止时间为2018年12月30日，以患者死亡为随访终点，计算全部患者的总生存时间。

2 结果

2.1 癌组织和癌旁组织Cx43表达比较 全部患者癌组织Cx43的相对表达水平为(0.82±0.31)，低于癌旁组织的(1.00±0.25)，差异有统计学意义(t=2.392，P=0.020)。

2.2 两组患者临床病理资料比较 低表达组TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、Clark分级为Ⅴ级的比例高于高表达组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组其他病理资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 两组患者生存情况比较 全部患者共随访4～48个月，中位生存时间25.3个月，1年、3年生存率分别为87.5%、26.8%。低表达组患者的中位生存时间为17.9个月，低于高表达组的32.6个月，差异有统计学意义(χ2=16.875，P<0.05)。

图1 两组患者生存曲线比较

2.3 多因素Cox回归模型结果 以患者的生存状况(0=存活，1=死亡)为因变量，相关临床病理资料为自变量(赋值情况见表2)，采用最优回归方程筛选变量以进行Cox回归，结果表明，癌组织Cx43低表达、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、发病部位为非肢端是皮肤恶性黑色素瘤患者预后的独立影响因素(P<0.05)。见表3。

表1 两组患者临床病理资料比较

表2 自变量赋值表

表3 多因素Cox回归模型结果

3 讨论

Cx43是Cx家族中最常见的成员之一，主要功能是参与细胞的缝隙连接通讯，从而介导细胞与细胞之间的信息交流，与乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌等多个恶性肿瘤关系密切[7-9]。从结构上说，Cx43蛋白的C端结构域上有多个结合位点，能与不同的蛋白进行相互作用，故功能较为复杂，甚至具有两面性，其在多数恶性肿瘤上作为肿瘤抑制因子，能抑制肿瘤细胞的增殖[10-11]。Ismail 等[12]研究表明结肠癌的癌组织中Cx43的表达较癌旁组织显著下调，癌细胞的Cx43表达水平也明显降低。Liu等[13]研究表明卵巢癌组织中Cx43的阳性表达率显著低于正常卵巢组织，且过表达Cx4能减少SKOV3(一种卵巢癌细胞系)的增殖能力与肿瘤形成。但是，近年来有发现其能促进部分肿瘤细胞的侵袭与迁移。Poyet等[14]研究表明膀胱癌组织中Cx43表达升高，其认为Cx过表达 能增强肿瘤细胞之间的缝隙连接活性，从而促进肿瘤细胞的进展。本研究分析了皮肤恶性黑色素瘤患者癌组织和癌旁组织的Cx43表达水平，并进行生存分析，发现了影响患者预后的预测因素，为临床预后评估提供了参考。

本研究结果显示，癌组织Cx43的相对表达水平显著低于癌旁组织(P<0.05)，提示Cx43在皮肤恶性黑色素瘤中可能作为肿瘤抑制因子，与既往体外实验结果类似[4]。李玢等[5]研究构建了小鼠黑色素瘤细胞(B16)过表达野生型与点突变型Cx43的细胞模型，结果表明过表达野生型Cx43能明显增强的细胞缝隙连接通讯功能增强，而过表达突变型Cx43则减弱细胞缝隙连接通讯功能。本课题组前期研究[15]表明，Cx43的表达可能与黑色素瘤的侵袭能力与预后有关，Cx43 表达水平越低，肿瘤侵袭能力越强、病情越严重，且患者往往预后较差。本研究还发现Cx43低表达组TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、Clark分级为Ⅴ级的比例明显高于高表达组(P<0.05)。Clark分级是黑色素瘤细胞的浸润程度评分，Ⅴ级代表已浸润到皮下组织，病情最为严重，提示癌组织Cx43表达水平与肿瘤的分期、浸润程度有关。本研究全部患者中位生存时间为25.3个月，低表达组患者的中位生存时间更低，仅为17.9个月，显著低于高表达组的32.6个月(P<0.05)；多因素Cox结果也证实癌组织Cx43表达水平是患者预后的独立预测因素(P<0.05)，低表达者的死亡风险是高表达者的2.156倍，提示Cx43的表达水平与肿瘤进展程度有关，可作为一个皮肤恶性黑色素瘤患者预后的预测因子，有待进一步研究探讨其具体机制。

综上所述，皮肤恶性黑色素瘤患者的癌组织Cx43表达水平明显低于癌旁组织，癌组织Cx43呈低水平表达、TNM分期较晚、非肢端发病是影响患者预后的预测因素。本研究亦有不足之处，属于单中心研究，纳入的病例数较少，下一步将继续扩大样本量以验证结论。