“长期负性情绪积累肝失疏泄加速脑老化进程”假说的思考和探索＊

秦中朋，詹向红

（河南中医药大学认知神经科学实验室 郑州 450046）

“夫百病之始生也，皆生于……，阴阳喜怒，……大惊卒恐。”《内经》中如此论述不良情绪对于疾病的影响，而近年来随着人口老龄化程度的持续加剧、社会竞争的日趋激烈和生物-心理-社会医学模式的认可实践，由长期负性情绪积累引发的疾病愈发多见且已被证实是脑老化相关疾病如轻度认知功能障碍（Mild cognitive impairment，MCI）、痴呆等的危险因素[1，2]。痴呆病死率高，危害严重，一旦罹患对大脑造成的神经元损伤不可逆转[3]，给家庭和社会造成沉重的负担[4，5]，并且当前药物研究的局面不甚乐观[6]。而缓衰益智是中医学的优势领域，一般认为，痴呆等脑老化疾病主要病位在脑，与五脏六腑功能失调[7]和痰浊血瘀阻塞脑窍[8]进而引起的精气血津液运行输布有碍、不能上充于脑关系密切，然而精气血津液的运行输布和五脏功能的正常发挥均有赖于全身气机的通调畅达，肝主疏泄、调畅全身气机是中医学的特色命题，因此肝失疏泄对脑老化相关疾病的影响亦不容忽视。但是肝失疏泄如何影响脑老化相关进程，其现代医学机制又是怎样呢？当前文献却少有报道，因此课题组进行了如下的思考和探索。

1 确定科学假说

现代医学研究发现，长期负性情绪积累人群易处于慢性情绪应激状态[9]，经久不调容易造成下丘脑-垂体-肾上腺（Hypothalamic pituitary adrenal，HPA）轴[10]的过度激活，继而引起糖皮质激素水平的持续升高，而作为学习记忆关键部位的海马，富含糖皮质激素受体，对应激反应更加敏感，极易受到损害[11]，导致学习记忆能力下降继发痴呆等。中医学中亦有“情志失调影响脑老化进程”相关记载：如《景岳全书》曰：“痴呆症……，或以郁结，或以不遂，或以思虑，或以惊恐而渐痴呆”；《辩证录·呆病门》论述：“大约起始也，起于肝气之郁”，明确指出肝气郁结肝失疏泄可能是脑老化加速并导致痴呆的始动因素。现代中医学者对此亦有认识：陈立典团队[12]通过调查统计发现肝病位证素占到了福州市老年MCI 人群中医证素的第一位；龚华强等[13]通过对认知障碍门诊中的MCI患者进行中医证候调查，发现肝气郁结证候占据所有MCI 患者中医证候的首位，占比达到38.50%；于梅等[14]通过对157例老年期痴呆病人进行中医辨证分型调查发现：具有肝气郁证候的痴呆病例占比达39.49%；田金洲团队[15]等通过文献研究MCI 证候要素分布，发现肝病在中医病位证候中占到14.17%。一般认为，情志是中医学对于情绪的特有称谓，其不仅是个体接受外界刺激后产生的主观反映，同时也是五脏六腑的功能活动以及精气血津液充盛与否的内在表现。若长期情志失常，经久不调，势必导致肝失疏泄，气机失常，气血逆乱，精气血津液运行输布有碍，或气血亏虚，脑失濡养；或痰瘀互结，清窍阻塞，化毒为害；或二者并见，虚实夹杂继而伤及脏腑，扰乱神志，导致神机失灵，引发认知功能障碍而脑老化加速。

因此综合以上研究分析，结合对现代医学、中医学研究现状的总结和讨论，课题组提出了“长期负性情绪积累肝失疏泄加速脑老化进程”的科学假说，认为旷日持久的情志失常，经久不调会导致肝失疏泄，影响全身气机的正常运转，进而影响五脏精华之血和六腑清阳之气的输布汇聚，最终导致脑之神机失用，加速脑老化等相关进程。课题组依托国家自然科学基金和国家重点基础研发计划的系列资助，进行了该假说的一系列探索和实验，在一定程度上验证了“长期负性情绪积累肝失疏泄加速脑老化”的部分机制，并探索创新了一些比较成熟的研究技术和方法。

2 创新实验方法

近年来，课题组在“肝失疏泄加速脑老化”这一科学假说指导下，探索并创新间接电击激怒法的单一长期愤怒诱发模型和复合长期负性情绪应激动物大鼠模型、首创正常人群愤怒情志诱发试验材料的影片片段、探索并完善被试者的一般情况记录表及认知功能筛查方案、制作并完善多个事件相关电位技术（Eventrelated potentials，ERPs）研究范式等。

2.1 创新“单一”长期愤怒情绪、复合负性情绪应激大鼠动物模型和正常人群愤怒情绪诱发材料

一般认为，动物实验是从宏观到微观层次深入认识疾病发生发展机制的重要媒介。因此在探索长期愤怒情志影响脑老化进程的研究中，课题组首先从动物实验开始，基于常见愤怒情绪造模方法如直接电击法所诱发的情绪较为多样复杂、兼有一定的恐惧情绪特征和愤怒情绪击中率不高；间接夹尾刺激法对攻击鼠易造成尾部皮肤损伤且进行夹尾操作时攻击鼠往往出现不攻击应激鼠反而回头撕咬止血钳的情况；居住入侵法等所诱发的愤怒情绪程度轻和时间短不能满足长期愤怒情绪的要求（表1）。因此受直接电击法和间接夹尾刺激法启发[16，17]，课题组改良了间接电击激怒法的长期愤怒情绪大鼠动物模型[18，19]：实验过程中使用电极末端电击刺激攻击鼠胸腹部，攻击鼠受电击刺激后被激惹，不久即对其前方实验组大鼠发起攻击，双方互相对峙、打斗、撕咬，继而产生愤怒心理。使用间接电击法每天刺激攻击鼠15 min，刺激频率为1-2 次/min，连续干预4 周后结果显示：实验组大鼠鼠毛竖立、怒目而视、佯攻尖叫、威吓对峙，甚至撕咬、攀压、打斗等，表情行为较好符合愤怒应激状态特征[20]。该造模方法诱发愤怒情绪较为单纯、应激持续时间长、躯体应激刺激少，较为适合“单一”长期愤怒情绪大鼠动物模型的制备。此外需要说明的是：以上造模方法所诱发的愤怒情绪仍然是混合情绪，并非严格意义的单一长期愤怒情绪，但相比较于当前文献其他愤怒情志造模方法，该法诱发愤怒情绪的击中率和持续时间更长，更加接近于单一长期愤怒情绪的研究目的。

表1 常见愤怒情志应激大鼠动物模型的特点

表2 常见长期负性情绪应激（抑郁）大鼠动物模型的特点

在间接电击法制备单一愤怒情绪大鼠模型基础上，课题组继而改良并优化了多情交织作用下的复合长期负性情绪应激大鼠动物模型[21]。鉴于常见慢性负性情绪应激造模方法如慢性束缚法造模时间长且可能对动物本身产生躯体应激[22，23]、空瓶应激法所诱发的情绪重复性低、居住入侵（社交失败）法造模成功率低[23]等缺点，而慢性轻度不可预知性心理应激（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）造模方法可通过给予大鼠温和、随机和长期不同的应激因子而较好诱发和模拟人类的慢性长期抑郁状态[24]（表2）。因此课题组选用改进的CUMS诱导方法[25-27]，并创新将其中易产生躯体应激的直接电击和禁食禁水等刺激分别替代为慢性不可预知性心理应激因子间接电击和惩罚性饮水[28]、将每种心理应激刺激时间稍微延长以更好诱发抑郁情绪并最大程度减少可能引起的焦虑因子[29]，最终将CUMS模型综合改进为下述8种不同的心理应激因子，实验过程中每天随机序贯对应激组大鼠施以其中的一种[30，31]：①束缚：使用束缚筒束缚大鼠6 h·天-1；②温水游泳：15 min·天-1；③间接电击刺激攻击鼠：15 min·天-1，频率为1-2 次·min-1；④强光刺激：5 h·天-1，照明频率为300 闪光·min-1；⑤摇晃：设置振荡器30 min，频率160 次·min-1；⑥潮湿垫料：12 h；⑦噪声：3 h·天-1，强度为 90 dB；⑧惩罚性饮水：10 min·天-1等，持续造模4 周后结果发现：应激组大鼠目光无神，毛发零乱，摄水摄食量明显减少，头部蜷缩在身体中，夜间不时发出细声尖叫，以上表情行为较好符合长期负性情绪抑郁状态。此方法充分借鉴了上述间接电击法的造模优势，合理控制了躯体刺激成分，并将心理应激因子随机序贯干预且使单一应激因子的作用时间稍微延长，较为适用于制备长期负性情绪应激抑郁大鼠模型。

鉴于动物实验研究成果无法直接推及正常人群，课题组继而创新制备了正常人群愤怒情绪诱发材料[32]：基于使用图片、音乐或气味等诱发的靶情绪强度和生态效度不理想，而影片采用视听双通道高强度诱发靶情绪且具有较高的生态学效度。因此课题组成员充分参考国内外情绪研究者使用的影片材料，经过大量走访、调查并听取多方权威专家、电影制片人和导演推荐，初步剪辑合成4部愤怒情绪诱发影片片段，经过伦理委员会批准后随机选取某高校161名学生自愿者随机观看以上影片，以情绪诱发强度、击中率、差异显著性等作为靶情绪诱发强度评定指标，并经二次优化改良后删掉以上合成影片中令人厌恶的镜头和其它血淋淋的场面，最终再次选取75名自愿者观看后发现：制作合成的《罪恶和审判》影片片段诱发愤怒情绪最佳[33]。

2.2 探索并制作认知功能的流行病学调查软件及一般情况记录表等筛查方案

当前对于脑老化相关疾病如MCI、痴呆等重要的诊断方法仍是量表检测，课题组通过查阅大量文献和开展系列预试验后发现：联合使用蒙特利尔评估量表（Montreal Cognitive Assessment, MoCA）和简易精神状态量表（Mini-mental state examination, MMSE）初筛MCI患者，并用日常生活活动能力量表、全面衰退量表以及自编一般情况调查表[34]（包括性别、年龄、职业、婚姻状况、受教育年限、家庭经济情况、家庭居住地、是否患有或曾患有影响认知功能的疾病、是否服用药物以及听视觉障碍等信息）以再次确诊MCI 患者的流行病学调查方案最佳[35]，并已将以上成果申报制作流行病学筛查软件且经过多个国家自然科学基金试验验证以上方案有效可行。

2.3 制作、改良并完善工作记忆、前瞻记忆及执行功能事件相关电位实验范式

近年来，ERPs以其高时间分辨率、低成本、客观性强、对人体无创伤且便于反映认知的动态时间特征等优势被誉为是观察脑高级功能的窗口，因此课题组将ERPs探索引入研究“长期负性情绪积累肝失疏泄加速脑老化”的相关神经电生理机制中。鉴于脑老化等认知障碍性疾病多以记忆力下降为主，其中工作记忆[36]、前瞻记忆[37]及其相关的执行功能[38]是其重要的受损成分，课题组先后完善并改良了研究以上成分的ERPs范式：分别采用不同任务负荷的中文版数字广度N-back 实验范式以评估肝失疏泄型MCI 患者言语和空间工作记忆受损情况[39]；采用标准版红黄绿3 种颜色和人物、动物、植物和日用品4 类常见的400 个汉语词语组成的“色词”前瞻记忆双任务研究范式评估被试者前瞻记忆水平：进行中任务为每一次刺激呈现时，请被试者在规定时间内判断屏幕中间出现的2个词语是否属于同类，如果相同，则按【J】键，如果不同，则按【F】键。前瞻记忆任务为：若屏幕中间显示的2个词语为随机数确定的红黄绿3 种特定颜色中的1 种，被试者则不用进行词类判断，只需按下空格键。通过预试验研究结果显示以上范式可较好诱发前瞻记忆P200、N300、PP 等特异性ERPs 成分；在此基础上，我们又创新完善了执行功能3个相关范式评估被试者执行功能受损情况：分别是红黄绿3 种颜色和红黄绿3 个字组成的色词stroop 抑制控制试验范式、N-back 数字广度记忆刷新试验范式以及1-9（不包括5）共8 个数字和红绿2种颜色组成并根据不同颜色分别判断数字大小和奇偶的灵活转换试验范式，并经相关预试验研究证实以上范式有效可行。

3 逐层开展探索

课题组从2006 年开始，经伦理委员会批准，先后在河南省郑州市及其周边城市、山东省济南市及其周边城市等多地进行了“肝失疏泄加速脑老化进程”3个层次的深入研究，逐层探索了单一长期负性情绪积累（愤怒情绪）对认知老化进程的影响、多情交织作用下的长期负性情绪积累（复合情绪）对认知老化进程的影响、疏肝解郁方药对认知老化进程的影响及机制研究，其具体步骤和成果简述如下：

3.1 单一负性情绪积累（愤怒情志）对认知老化进程的影响

中医学对“怒伤肝”理论颇有认识，如《内经》有云：“肝在志为怒，怒伤肝，悲胜怒”，另有“大怒则形气绝，而血菀于上，使人薄厥”等论述。怒作为负性情绪的重要组成部分，当前社会环境下其对个体身心健康和认知老化进程如痴呆等影响愈发突出[40]。因此，课题组首先从单一长期负性情绪积累愤怒情绪入手，以动物、阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）患者和正常在校大学生为试验对象，分别进行了愤怒情绪与认知功能减退的动物实验研究、愤怒情绪积累与认知功能减退的回溯性病例对照研究、愤怒情绪对正常人群的工作记忆研究和个体差异ERPs 研究。在动物实验研究中，课题组先后通过大鼠旷场实验，大鼠的病理组织大脑皮层、海马及神经元形态学和超微结构检测，血浆氧化指标检测，神经内分泌HPA 轴功能检测等，证实长期愤怒情绪可显著降低大鼠空间学习记忆能力，加重大鼠大脑海马神经元退行性病变，HPA 轴过度激活，提示长期愤怒情志可明显加速大鼠脑老化进程[18]；那么愤怒情绪对AD 患者的影响是怎样的呢？课题组在动物实验研究基础上，对部分AD 患者进行了愤怒情绪积累与认知功能减退的回溯性病例对照研究[41]：发现其OR值（95%CI）为51.857（14.009,191.954），提示长期愤怒情绪积累是AD 发病的危险因素；那么愤怒情绪对正常人群的影响是否也是如此？为使动物实验和临床患者研究成果推及正常人群，课题组使用工作记忆行为学测试软件对高低愤怒特质组正常大学生施以课题组制作的愤怒情志诱发影片[32]后发现：高愤怒被试者工作记忆容量下降，高特质怒唤醒状态可改变神经内分泌功能；并在此基础上，课题组进一步使用go/nogo 试验范式对高低特质被试者进行ERPs 研究抑制控制能力后发现：与低特质怒个体相比，高特质怒个体nogo 刺激时平均脑电P300 波幅较小，提示高特质怒者抑制控制能力较低[42]。以上试验分别证实长期愤怒情志可加速大鼠和AD 患者认知老化进程，影响正常人群认知功能。

然而，当前生物-心理-社会医学模式下负性情绪应激往往呈现多情交织共同致病，如乔明琦课题组[43]通过对553 例情志病患者流行病学调查发现：两种或两种以上负性情绪多情交织共同致病者高达88.97%，周莺等[44]、张慧等[45]分别通过研究古代和清代情志病证医案，同样发现多种情质因素共同致病最为常见。那么多情交织作用下的长期负性情绪积累对于认知老化进程的影响又是怎样呢？

3.2 长期负性情绪积累对认知老化进程的影响

以长期负性情绪积累为自变量，课题组分别进行了动物实验研究、正常人群的ERPs 研究和MCI 与正常人的病例对照研究。在动物实验中，课题组采用上述优化和改良的长期负性情绪应激大鼠模型，分别进行了旷场实验、大脑皮层形态学、血浆氧化指标、HPA轴指标、谷氨酸和Ca2＋浓度、海马神经元NMDAR、CaM、CREB 检测以及甲基化程度等检测，结果显示：相比较对照组，长期负性情绪应激组大鼠学习记忆能力下降，海马CA1 区神经细胞数目明显减少、排列松散、胞核染色变浅且伴有胶质细胞增生，HPA轴ACTH、CORT等激素含量明显升高，大鼠海马NMDAR 含量显著增加[21]，NR2B 和 BDNF 基因启动子区 CpG 甲基化程度显著增高[31]，提示长期复合负性情绪积累可加速大鼠认知老化进程；在动物实验研究基础上，经伦理委员会批准，课题组筛选长期负性积累人群自愿者并对其进行了流体智力检测，衰老生物学指标8-OHdG、SOD、LPO检测，端粒长度、活性以及ERPs试验，结果显示长期负性情绪积累人群总体智力水平和反映速度有所下降[46]、衰老生物学以上3 个指标均高于对照组，端粒长度和端粒酶活性均低于对照组[47]，脑电试验N1 波幅、PP 潜伏期延长，认知加工速度下降[48]，提示长期负性积累可加速正常人群脑老化进程；鉴于AD 病程的不可逆和目前不甚乐观的药物研究局面，课题组招募AD 前期的肝气郁结型MCI 患者进行了病例对照研究，其OR 值（95%CI）为5.364（1.774, 16.225），提示长期负性情绪积累是MCI 的危险因素。以上研究结果证实长期负性情绪积累可加速动物、MCI 患者认知老化进程，影响正常人群认知功能。鉴于中医学在未病先防、既病防变的缓衰益智方面具有独特优势，那么使用疏肝解郁的方法对长期负性情绪积累MCI 患者进行用药干预，能否改善其认知功能，其神经机制又是什么呢？

3.3 疏肝解郁方药对认知老化进程的影响及机制研究

肝主疏泄的调控部位在脑，而高空间分辨率的功能磁共振技术（Functional magnetic resonance imaging，fMRI）可较为立体而准确地定位脑功能和结构的损伤部位，因此我们将fMRI技术引入到研究疏肝法对认知老化进程的影响及机制中。

经河南中医药大学第一附属医院伦理委员会批准（批号：2015HL-059），课题组选取长期负性情绪积累肝失疏泄MCI 患者的一种常见中医证型—肝气郁结证进行研究，使用上述认知功能筛查方案和肝气郁结证症状程度计分表[49]（需要说明的是，课题组在使用肝郁量表评判被试者肝郁程度时，会向被试者强调说明该量表选项中的每个症状发生时间均要持续3个月以上，以尽可能保证被试者的肝郁症状是长期情志不畅而非一时之郁），综合筛选46-65周岁的肝气郁结型MCI 用药组、肝气郁结型MCI 未用药组和正常对照组3组自愿者，使用疏肝解郁代表方药逍遥丸（河南省宛西制药股份有限公司，批号：140409）对肝气郁结型MCI 用药组自愿者进行连续3 个月用药干预，并分别进行用药前后3 个月的两次工作记忆的ERPs 检测、fMRI 的磁共振波谱、功能连接和局部一致性研究，以及衰老生物学指标检测和韦氏成人记忆量表检测等，结果发现肝气郁结型用药组MCI患者干预后MoCA 量表总分和所有认知域得分均有所增加[50]，磁共振波谱显示用药后右后扣带回胆碱与肌酸的比值降低[51]，衰老生物学指标8-OHdG 含量降低，端粒酶活性升高[52]，Oddball任务中P300波幅已与正常无显著差异，N-back任务下P300潜伏期延长，提示肝郁型MCI患者用药干预3 个月后可逐渐恢复记忆模板；N400 潜伏期缩短、波幅降低，提示疏肝法可显著改善MCI 患者认知功能，其机制可能与降低肝郁MCI 患者的氧化应激水平、降低海马环路中后扣带回区域胆碱化合物水平以及改善工作记忆的编码、储存能力等有关。

4 总结和展望

综上所述，课题组围绕“长期负性情绪积累肝失疏泄加速脑老化进程”的科学假说，依次从单一长期负性情绪（愤怒特质）研究拓展到多情交织作用的长期复合负性情绪积累，从动物实验研究拓展到正常人群再到AD 和MCI 患者，从未用药研究拓展到疏肝解郁方药干预肝气郁结型MCI 患者，并充分结合高时间分辨率的ERPs和高空间分辨率的fMRI等现代神经心理学技术，有效证实了长期负性情绪积累肝失疏泄可加速脑老化进程；并在一定程度上提示使用疏肝法可在改善肝郁型MCI 患者肝郁症状的同时，也可有效改善和提高其总体认知功能。

需要说明的是，新近有研究证实前瞻记忆[37]和执行功能[38]损伤也是认知功能衰退的早期敏感指标，并且两成分损害呈现正相关[53]。此外，一般认为眼睛（目）是大脑思维活动和情绪变化的外在反映，同时也是大脑获得外界信息的主要渠道，即察目可通于神，“肝开窍于目”、“目系通于脑”，且当前多项研究报道眼动技术可提供敏感的、非侵入性的认知（变化或恶化）的标记，是早期诊断MCI 及AD 的敏感工具[54]。因此，课题组下一步将从前瞻记忆和执行功能角度入手，联合使用神经心理学ERPs、fMRI 和眼动技术等，对疏肝法改善肝郁型MCI 患者的神经心理学机制进行多维度深入研究，以期为MCI 的中医临床干预提供新思路，为中医脑老化学说增添新内涵。