貂源冠状病毒与2019新型冠状病毒的遗传进化关系

杨艳玲，程世鹏，任林柱

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林长春 130122；2.吉林大学动物科学学院，吉林长春 130062）

水貂冠状病毒（mink coronavirus，MCoV）最早流行于美国的犹他州，1987年我国从北美进口种貂时带入该病毒[1]。近年来，我国山东省水貂养殖场中曾有MCoV感染发生，但感染率不高，致死率较低。MCoV主要引起水貂流行性卡他性胃肠炎，主要临床表现为：腹泻，排灰白色、绿色及粉黄色黏液状稀便，有的排黑红色、没有明显套管样稀便；同时伴有食欲不振、呕吐、精神萎靡、口渴、鼻镜干燥、被毛欠光泽、消瘦、皮肤缺乏弹性等症状；体温一般不高，多因脱水发生自体中毒而死亡[2]。

人冠状病毒HCoV-19为2019年在我国武汉市引起人严重呼吸道感染的新型冠状病毒，最初被命名为2019-nCov，后被国际病毒分类委员会更名为SARS-Cov-2。但是，由于SARS-Cov-2与SARS-Cov不同，将该病毒命名为SARS-Cov-2容易引起歧义，因此现在我国科学家将该病毒命名为HCoV-19[3-6]。

为进一步明确我国貂源冠状病毒与新型冠状病毒（HCoV-19）的遗传进化关系，本研究比较了NCBI上公布的3株水貂冠状病毒、5株雪貂冠状病毒以及人冠状病毒HCoV-19 和SARS-Cov的全基因组、ORF1a、ORF1ab以及病毒表面蛋白Spike的序列同源性，并分析了其遗传进化关系以及组成病毒的所有结构和非结构蛋白的种类、基因位置及氨基酸数量。

1 材料与方法

1.1 基因序列

下载并整理NCBI上公布的3株水貂冠状病毒、5株雪貂冠状病毒、1株人源新型冠状病毒HCoV-19（GenBank登录号NC_045512）和1株人源SARS-Cov（GenBank登录号AY274119）的全基因组序列。3株水貂冠状病毒包括：1株中国株（GenBank登录号MF113046）[2]，2株美国株（GenBank登录号HM245926、NC_023760）[7]；5株雪貂冠状病毒包括：2株美国株（GenBank登录号KX512810、KX512809），2株日本株（GenBank登录号LC215871、LC119077）[8]，1株荷兰株（GenBank登录号NC030292）。

1.2 序列同源性及遗传进化关系分析

根据下载的10株冠状病毒基因组序列，分别整理每一株冠状病毒的全基因组序列、ORF1a、ORF1ab和病毒表面蛋白Spike的编码基因序列及其蛋白序列，并利用DNAMAN软件进行序列同源性比对及进化树绘制。

同时，对冠状病毒结构蛋白和非结构蛋白的种类、基因位置及氨基酸数量进行统计整理，用于分析不同冠状病毒株的全基因组成差异。

2 结果与分析

2.1 病毒分类

根据国际病毒分类委员会（ICTV）对冠状病毒的分类标准，HCoV-19属于巢病毒目冠状病毒科正冠状病毒亚科Betacoronavirus属Sarbecovirus亚属类SARS病毒种，而水貂冠状病毒MCoV属于α冠状病毒，与雪貂冠状病毒同属于α冠状病毒2亚属。为此，在病毒分类上，水貂冠状病毒、雪貂冠状病毒与新型冠状病毒HCoV-19不是同一属的冠状病毒。

2.2 全基因组相似性

比较了NCBI上公布的3株水貂冠状病毒、5株雪貂冠状病毒、HCoV-19和SARS-Cov的全基因组序列相似性。结果显示，貂源冠状病毒与HCoV-19的基因组序列相似性为68.42%，其中水貂冠状病毒中国分离株与HCoV-19的全基因组相似性为50.57%，与SARS-Cov的相似性为50.34%（表1）。以上分析表明，HCoV-19与貂源冠状病毒的基因组相似性较低。

2.3 基因组遗传进化关系

貂源冠状病毒与HCoV-19的全基因组遗传进化分析显示，8株貂源冠状病毒与2株人源冠状病毒（HCoV-19和SARS-Cov）不属于同一种冠状病毒分支，而且遗传进化关系较远。2株人源冠状病毒（HCoV-19和SARS-Cov）属于同一种冠状病毒下的同一分支，亲缘关系较近；8株貂源冠状病毒属于同一种冠状病毒分支，但是其中的3株水貂冠状病毒和5株雪貂冠状病毒又各自形成一个独立分支，即水貂冠状病毒与雪貂冠状病毒不属于同一分支（图1）。为此，通过全基因组遗传进化关系分析，可以明确貂源冠状病毒与新型冠状病毒HCoV-19不在同一分支，亲缘关系较远。

表1 水貂冠状病毒中国分离株与其他冠状病毒的同源性 %

图1 貂源冠状病毒与HCoV-19全基因组进化关系

2.4 ORF1a和ORF1ab一致性

冠状病毒ORF1a和ORF1ab非结构蛋白序列一致性是国际病毒分类委员会对冠状病毒种属分类的依据。如果两个冠状病毒的序列一致性大于90%这个阈值，则表示两个冠状病毒属同一种。通过对水貂冠状病毒和人冠状病毒ORF1a基因序列的分析发现，水貂冠状病毒与HCoV-19的ORF1a基因相似性为46.96%，ORF1ab基因相似性为52.44%；与SARS-Cov的ORF1a基因相似性为47.39%，ORF1ab相似性为52.24%。水貂冠状病毒与HCoV-19的ORF1a蛋白相似性为 72.02%，ORF1ab蛋白相似性为76.53%；与SARS-Cov 的ORF1a蛋白相似性为72.46%，ORF1ab蛋白相似性为 76.69%（表1）。ORF1a和ORF1ab的基因遗传进化关系分析显示：貂源冠状病毒与人源冠状病毒不属于同一种，亲缘关系较远，而HCoV-19和SARS-Cov属于同一分支。另外，雪貂冠状病毒和水貂冠状病毒同属一个种下的不同分支（图2～3）。通过对ORF1a和ORF1ab一致性分析，进一步明确了貂源冠状病毒和人源冠状病毒不是同一种冠状病毒。

图2 貂源冠状病毒与HCoV-19的ORF 1ab进化分析

2.5 Spike蛋白同源性

图3 貂源冠状病毒与HCoV-19的ORF 1a进化分析

刺突糖蛋白（Spike glycoprotein，S glycoprotein）是病毒与人源细胞上血管紧张素转换酶2（ACE2）受体结合，帮助病毒进入宿主细胞的重要成分，是冠状病毒疫苗设计、治疗性抗体研究、临床诊断试剂开发及抗病毒药物发现的关键靶点，也是冠状病毒进化过程中比较容易变异的主要成分。本研究分析了不同貂源冠状病毒以及HCoV-19、SARS-Cov的S蛋白编码基因同源性。结果显示：貂源冠状病毒与HCoV-19的S蛋白编码基因相似性为47.36%，与SARS-Cov的相似性为46.15%；HCoV-19和SARS-Cov两株冠状病毒的S蛋白编码基因相似性为74.29%；3株水貂冠状病毒间的S蛋白相似性为85%，5株雪貂冠状病毒间的S蛋白相似性为88.4%；水貂与雪貂冠状病毒间的S蛋白相似性为74.86%。Spike 蛋白遗传进化分析显示：貂源冠状病毒与HCoV-19不属于同一分支，遗传进化关系较远；3株水貂冠状病毒的S蛋白和5株雪貂冠状病毒的S蛋白属于同一种下的两个分支（图4）。可见，貂源冠状病毒与HCoV-19 的Spike蛋白同源性较低，遗传进化关系较远。

图4 貂源冠状病毒与HCoV-19 Spike蛋白的进化分析

2.6 全基因组的蛋白组成、基因位置和氨基酸数量

为进一步明确貂源冠状病毒与人源冠状病毒HCoV-19的结构差异，分别对1株水貂冠状病毒中国分离株、1株水貂冠状病毒美国分离株、1株雪貂冠状病毒和1株人冠状病毒HCoV-19武汉分离株的主要蛋白、各组分基因位置及氨基酸数量进行比对分析。结果显示：4种不同冠状病毒在蛋白组成上存在显著差异，其中HCoV-19编码的结构和非结构蛋白有12个，而水貂冠状病毒仅有10个，雪貂冠状病毒有9个。另外，相同蛋白编码基因的位置相差也较大，尤其是N蛋白。HCoV-19的N蛋白在基因组28 274～29 533核苷酸之间，而水貂和雪貂的N蛋白位置比较相似，分别位于基因组26 454～27 584和26 368～27 492核苷酸之间。此外，氨基酸的数量差异也比较大，如ORF1a、ORF1ab、S蛋白等重要结构蛋白在貂源冠状病毒与HCoV-19之间差异十分显著（表2）。以上分析表明，貂源冠状病毒与新型冠状病毒的蛋白组成、基因位置和氨基酸数量均存在明显差异。

3 讨论

冠状病毒是一类家族庞大的病原微生物，目前有α、β、γ和δ 4个属[9-10]。而且感染宿主比较广泛，包括多种野生动物、家养哺乳动物、家禽等。已知感染猪的冠状病毒有6种，分别是猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪呼吸道冠状病毒（PRCV）、猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）、猪血凝性脑脊髓炎病毒（PHEV）和猪δ冠状病毒（PDCoV）[11]。家禽冠状病毒感染危害较大的是属于γ冠状病毒属的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）。此外，鸭冠状病毒、鹅冠状病毒和鸽冠状病毒等在家禽中也有检出。一些野禽可感染δ属冠状病毒（如鹅口疮冠状病毒HKU12等）[12]。牛冠状病毒（BCoV）是β冠状病毒属的成员，主要引起犊牛胃肠炎、呼吸道疾病、奶牛冬季痢疾及牛运输发热性肺炎等[13]。有研究分别对猪冠状病毒[11]、禽冠状病毒[12]与人冠状病毒HCoV-19进行了基因组相似性的比对及遗传进化关系分析，结果均发现猪和禽的冠状病毒与HCoV-19的基因组相似性仅为40%左右，相似性较低，这些冠状病毒与人冠状病毒的亲缘关系也较远。本研究分析发现，貂源冠状病毒与人源冠状病毒的全基因组相似性仅为68%，相似性较低，同时遗传进化关系显示，它们不在同一分支，而且亲缘关系较远。在病毒分类上，貂源冠状病毒属于α冠状病毒[14]，而人冠状病毒HCoV-19属于β属冠状病毒[7]。本研究结果也显示，它们不在同一分支。

表2 水貂冠状病毒与人冠状病毒全基因组蛋白的核苷酸位置及氨基酸数量

为明确貂源冠状病毒与HCoV-19的亲缘关系，对ORF1a和ORF1ab的氨基酸序列一致性进行了比对，结果发现貂源冠状病毒与HCoV-19的ORF1a和ORF1ab氨基酸一致性分别为72.02%和76.53%。根据国际病毒分类委员会的冠状病毒分类依据，ORF1a和ORF1ab的序列一致性需要大于90%这个阈值，才表示两个冠状病毒属同一种。本研究的数据分析结果进一步说明，貂源冠状病毒与人冠状病毒HCoV-19不属于同一种。同时，本研究还将貂源冠状病毒与HCoV-19的全基因组组成、基因位置及氨基酸数量进行了比较分析，结果发现两株冠状病毒在基因组构成上的差异十分显著，最明显的是两株冠状病毒的构成成分。貂源冠状病毒编码的阅读框有10个蛋白质，而HCoV-19有12个，且编码基因在基因组中的位置也有较大差异，尤其是N蛋白差别很大。通过对全基因组的详细对比分析发现，貂源冠状病毒与毒HCoV-19不是同一种冠状病毒。

4 结论

通过对HCoV-19武汉流行株和已经公布的水貂、雪貂冠状病毒株进行全基因组系统分析，明确了貂源冠状病毒与人冠状病毒HCoV-19不是同一种冠状病毒，而且亲缘关系较远；此次流行的人冠状病毒由貂源冠状病毒重组而成的可能性很小，可初步排除HCoV-19来源于水貂和雪貂的可能性。