气质联用法检测养殖虾中的5种雌激素残留

王丹华，陈盼盼*，王宏亮

1. 台州职业技术学院（台州 318000）；2. 临海市食品药品检验检测中心（台州 317000）

民以食为天，食以安为先。随着我国经济社会的不断发展，老百姓的餐桌不断丰富的同时，食品安全问题日益成为老百姓关注的焦点。虾，是老百姓非常喜爱的一类水产品，现阶段随着虾养殖业的不断发展，据调查少部分不法养殖户在养殖虾的过程中，使用雌二醇、己烯雌酚等雌激素，用以提高虾的养殖速度和产量。雌二醇等雌激素是一类有广泛生物活性的类固醇化合物，具有促进和维持女性生殖器官和第二性征的生理作用，并对内分泌系统、肌体的代谢和骨骼的生成和成熟有影响[1-4]；近年来，不断有调查发现大量水生生物出现性别畸形，如雌性贝类长出来了雄性器官、雄性虹鳟鱼体内发现有卵黄蛋白等，因此加强对养殖虾中的雌激素监测，具有重要的现实意义。

养殖水产品中雌激素的检测方法主要有液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法[5-13]。液相色谱法及气相色谱法专属性偏差，易出现假阳性的结果；液相色谱-质谱法检测雌二醇等低沸点的雌激素，灵敏度差；相比较而言，气相色谱-质谱法更适用于雌二醇、己烯雌酚等低沸点的雌激素，且气相色谱-质谱法检测成本更低，适于该方法的推广使用。加速溶剂萃取（ASE）的方法是一种在提高温度和压力的条件下，用有机溶剂萃取的自动化方法[14-15]。该方法有机溶剂用量少、快速、基质影响小等优点，已在食品、药品、环境等领域得到广泛应用。试验建立一种利用加速溶剂萃取法提取养殖虾中的雌二醇等雌激素，气相色谱-质谱法进行定性定量分析的方法。结果表明，该方法具有前处理简单、灵敏度高、检测结果准确等优点。

1 材料与方法

1.1 仪器部分

气相色谱-质谱联用仪（型号2010plus-TQ 8040，日本岛津）；色谱柱Rtx-5 MS（日本岛津）；氮气吹干仪（MTN型，北京华瑞博远）；电子天平（XS204型，0.1 mg，瑞士梅特勒）；纯水器（Milli-Q，美国Milli Pore）；加速溶剂萃取仪（Dionex ASE 350型，美国Thermo Fisher）。

高速冷冻离心机（FRESCO17型，热电（中国））；氮吹仪（N-EVAP-24型，美国Organomation公司）；恒温干燥箱（FED115型，德国Binder）。

1.2 试剂部分

雌二醇、己烯雌酚、雌酮、炔雌醇、雌三醇标准物质（纯度≥99%，德国Dr. Ehrenstorfor公司）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色谱纯，德国merck试剂公司）；纯化水（自制）；弗罗里硅土（分析纯，上海国药）；衍生化试剂：N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（NSTFA）、三甲基硅烷，美国Sigma公司。

1.3 色谱参数

气相色谱：进样口温度250 ℃；毛细管色谱柱：Rtx-5 MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气：高纯氦气（纯度≥99.999%）；氦气流量：1.5 mL/min；进样方式：不分流进样；进样量：1 μL。色谱柱温度：50 ℃保持1 min；20 ℃/min升温至160 ℃，15 ℃/min升温至280 ℃，保持8 min。

质谱：离子源，电子轰击源（EI）；电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；接口温度：250 ℃；溶剂延迟时间：2 min；检测方式：多反应监测模式（MRM）。

1.4 样品溶液配制

样品预处理：取养殖虾的可食用部分，充分匀浆后置于样品盒中冷冻保存，备用。

样品提取：称取5 g（精确至0.01 g）已预处理的样品，加入5 g弗罗里硅土，与样品充分混匀，用体积比1︰1的乙腈-乙酸乙酯混合溶剂作为提取溶剂，在加速溶剂萃取仪中萃取。萃取条件：提取温度85 ℃，压力10.0 MPa，静态提取时间6 min，提取次数3次，淋洗体积60%，氮气吹扫50 s。

向吹干的残渣中加入100 μL衍生化试剂，盖紧具塞试管并涡旋1 min，置于60 ℃烘箱中反应60 min，取出后冷却至室温，进样气相色谱-质谱测试。

1.5 溶液配制

衍生化试剂：N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（NSTFA）-三甲基硅烷（99︰1，V/V）。1.5.1 标准储备溶液

准确称取雌二醇、己烯雌酚、雌酮、炔雌醇、雌三醇标准物质，各0.1 g（精确至0.001 g），分别置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得1 mg/mL的各单标储备液；将储备液置于-18 ℃冰箱保存备用，保质期6个月。

1.5.2 标准曲线溶液

精密量取1 mg/mL雌二醇、己烯雌酚、雌酮、炔雌醇、雌三醇储备溶液，各1 mL，置于100 mL量瓶中，得到100 μg/mL混标液。移取一定量体积的混标液，配制含各雌激素质量浓度为0.01，0.05，0.1，0.2，0.5和1.0 μg/mL的系列混合标准溶液，用甲醇定容至刻度，摇匀。

2 结果与讨论

2.1 萃取条件的优化

萃取温度对萃取结果至关重要。试验考察了70，80，90，100和110 ℃ 5个不同温度对雌激素残留效果的影响。结果发现，当温度由70 ℃升至90 ℃时，各雌激素提取结果增加显著；当继续升温至110 ℃时，萃取结果基本恒定，因此选择90 ℃作为最佳提取温度。

2.2 洗脱溶剂选择

洗脱溶剂的选择至关重要，它直接影响样品的净化效果和分析物结果的准确度。洗脱溶剂必须要对此次试验的5种雌激素具有较好的洗脱能力。水产品中雌激素的分析常用的洗脱溶剂主要有甲醇、乙腈、乙酸乙酯。试验发现，当甲醇作为洗脱溶剂时，雌激素的灵敏度较低；当乙腈作为洗脱溶剂时，萃取效果好，回收率高，但是去除虾中的脂肪效果差，干扰物较多；乙酸乙酯洗脱，能有效地去除脂肪，且5种雌激素的回收率较高。乙腈和乙酸乙酯合用既有效去除脂肪，又能到较高的回收率。因此，选择体积比1︰1的乙腈-乙酸乙酯作为萃取雌激素的萃取溶剂。

2.3 质谱条件的选择

首先对5种雌激素（雌二醇、己烯雌酚、雌酮、炔雌醇、雌三醇）标准样液以Q3SCAN模式全扫描，以确定5种雌激素的保留时间，并找出各自的产物离子；在MRM模式下对产物离子进行碎片离子扫描，得到对应的碎片离子。选择响应值高的1个离子作为定量离子，另选3对离子作定性离子。选择好定量及定性离子后，对MRM方法进行轰击电压、离子比率等质谱条件的优化，确保目标峰灵敏度达到最佳。1对定量离子对、3对定性离子对结合保留时间，排除了假阳性样品的存在，确保5种雌激素检测结果准确。5种雌激素离子对及质谱相关参数选择如表1所示。

表1 5种雌激素残留离子相关信息

图1 5种雌激素标准谱图

2.4 标准曲线及检出限

吸取一定量1.5.2项下配制的标准曲线溶液至2 mL去活的样品反应瓶中，氮气吹至近干，加入100 μL衍生化试剂，按照1.4衍生化方法衍生操作。按1.3色谱质谱条件上机进样。以各雌激素质量浓度为横坐标，对应的响应值为纵坐标，绘制标准曲线。以信号噪声的比值（S/N=3）计算各激素的检出限。标准曲线及检出限结果见表2。

由表2可以看出，5种兽药激素在0.01～1.0 μg/mL线性范围内呈良好的线性关系，相关系数均大于0.995，且灵敏度高，农药检出限均在0.09～0.14 μ g/kg范围内。

表2 5种环境雌激素标准曲线、相关系数及检出限

2.5 加标回收试验与精密度测试

取不含待检5种雌激素的养殖虾空白样品，在标准曲线浓度范围内加入低（1 μg/kg）、中（5 μg/kg）、高加标量（10 μg/kg）三个不同浓度水平的雌激素混合标样，按照1.4方法处理样品，考察加标回收结果。每个浓度水平的加标样品平行进样6次，考察精密度6次测定结果的相对标准偏差。回收率与精密度检测结果详见表3。可以看出，5种雌激素3个浓度点的加标回收率在80.6%～93.9%之间，进样6次方法精密度RSD在1.67%～4.72%之间。

表3 6种环境雌激素加标回收率

2.6 实际样品的测定

抽取30份市场售卖的养殖虾（对虾、小白虾等），运用试验所建立的方法对5种雌激素残留进行检测。结果未发现5种雌激素的检出；说明本地养殖虾基地无雌激素添加的情况出现。

3 结论

试验建立了一种加速溶剂萃取-气相色谱质谱法检测养殖虾中5种雌激素（雌二醇、己烯雌酚、雌酮、炔雌醇、雌三醇）残留的方法。该方法采取加速溶剂萃取仪对养殖虾样品进行提取、净化，选择乙腈-乙酸乙酯（体积比1︰1）作为提取溶剂，采用衍生化方法进样气相色谱质谱对5种雌激素进行检测。试验对萃取条件进行了优化、对洗脱溶剂的选择使用进行了分析讨论；对质谱条件进行了优化；考察了方法的线性曲线及检出限、准确性（加标回收）与精密度等，并对实际样品进行了测试。结果表明，该方法具有前处理简单、灵敏度高、检测结果准确的优点，可用于养殖虾中该5种雌激素的监测。