基于多元素和稳定同位素的特基拉酒原产地鉴定

张建 ，马义虔 ，田玲*，邵飞龙 ，卢垣宇 ，陈兴林

1. 贵州省产品质量监督检验院（贵阳 550016）；2. 国家酒类及加工食品质量监督检验中心（贵阳 550016）；3. 深圳职业技术学院（深圳 518055）

特基拉酒（Tequila）是以墨西哥4个法定州（哈利斯科Jalisco、瓜纳华托州Guanajuato、米却肯州Michoacan、塔毛利帕斯Tamaulipas）内种植的蓝龙舌兰（Blue agave）为原料，经过蒸馏制作而成的一款蒸馏酒。2014年中国市场对墨西哥特基拉酒开放，承认墨西哥特基拉酒的原产地（地理标志）商标。中国对特基拉酒的进口量和消费量呈稳步增长趋势，出现不法商家以假乱真或以次充好现象，导致国内市场的特基拉酒质量参差不齐，品质和定价脱节。为此发展有效、快速、准确的鉴别特基拉酒产地和品质的新技术成为亟待解决的问题。

矿质元素指纹法[1-4]，香气指纹法[5]和稳定同位素质谱（IRMS）技术[6-8]等被应用于食品领域，其中稳定同位素比值法能很好地指示地域和气候特征，其广泛应用在食品产地溯源（如葡萄酒[9]、牛肉[10]和茶叶[11-12]）和真伪鉴别（如酿造酱油[13]和蜂蜜[14-15]）等领域。特基拉酒中矿质元素的含量与其生长环境（如土壤、水、气候）等密切相关，他们不易在酿造、陈酿过程中代谢或者改变，因此也是特基拉酒产地辨别的重要标识物。Bontempo等[16]用49种矿物质元素结合C、N、O、S、Sr稳定同位素比值对阿尔卑斯地区的10个奶酪样本进行原产地识别，样品正确归类率为94%。邵圣枝等[17]采用23种矿物元素含量和C、N、O、H稳定同位素比值结合化学计量学中主成分分析（PCA）和线性判别分析（LDA）对黑龙江省、江苏省和辽宁省23个稻米样本进行判别验证，正确率达91%。袁玉伟等[11]采用27种矿物元素含量和C、N、O、H稳定同位素比值，并结合化学计量学PCA-LDA对福建、山东、浙江产地茶叶的判定准确率为99%，说明利用稳定同位素和矿物元素结合化学计量学的方法能较好地进行茶叶产地溯源。

采用矿物元素和稳定同位素比值，并结合化学计量学中主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA），建立对墨西哥4个法定产区特基拉酒进行产地溯源和判别的方法，为中国进口墨西哥特基拉酒的原产地保护和真伪鉴别提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

DRC-e电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，美国Perkin Elmer公司）；DELTA V Plus同位素质谱仪（IRMS，配备Trace GC气相色谱仪，仪器控制软件为ISODATE 3.0，美国Thermo Fisher公司）；GasBench II前处理装置：GC PAL自动进样器，PoraPlot Q色谱柱（25 m，0.32 mm），螺旋盖样品瓶，进样针和吹气针；气相色谱柱（RTX-WAX，30 m×0.25 mm×0.25 μ m）。

炭黑中碳同位素标准物质δ13CVPDB=-3.691%±0.010%；氢氧同位素水标准物质GBW 04458：δ18OVSMOW=-0.015%±0.007%，GBW 04459：δ18OVSMOW=-0.861%±0.008%；高纯氦气（99.999%）；标准参考气CO2（中国盛盈公司）；多元素标准溶液（美国Perkin Elmer公司）；Milli-Q Gradient纯水处理系统（法国Millipore公司）。

1.2 材料

特基拉酒主要委托进口商从墨西哥4个法定产区购买原瓶原装：Jalisco 13支、Guanajuato 15支、Michoacan 15支、Tamaulipas 17支。4个产区共60支样本（44支特基拉酒用于产地溯源模型的建立，16支用于模型的验证）。

1.3 样品前处理

取特基拉样品25 mL，100 ℃水浴挥干酒精后用1%硝酸定容至25 mL，用于多元素分析[18]；取20 μL特基拉酒样品放入气相色谱瓶中，加入1 mL色谱纯丙酮，用于乙醇稳定碳同位素比值分析；取0.5 mL特基拉酒样品，放入螺旋盖样品瓶中，充入0.3% CO2和He混合气300 s，带走瓶中的空气，平衡18～24 h，使气体CO2与水中氧发生同位素交换，用于分析水中稳定氧同位素。

1.4 仪器条件

1.4.1 ICP-MS测定条件[18]

RF功率1 100 W；雾化器流速0.88 L/min；冷却气流速16 L/min；辅助气流速1.2 L/min；离子透镜电压6 V。砷元素的测定采用动态反应池模式，设定参数为Cell gas A 0.3；RPq 0.5。

1.4.2 IRMS测定条件

1.4.2.1 稳定碳同位素测定条件

色谱柱RTX-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样量1 μL；载气，高纯He；流速1.2 mL/min；分流比30︰1；进样口温度200 ℃；升温程序为，起始温度40 ℃，持续5 min，以10 ℃/min速率上升至80 ℃，在80 ℃保持1 min，以25 ℃/min速率上升至200 ℃，200℃保持15 min；燃烧管温度1 000 ℃，切入质谱时间200 s；离子源电压2.97 kV，真空度1.6×10-6mBar；轰击电压123.8 eV。

1.4.2.2 稳定氧同位素测定条件

载气，氦气；载气压力，0.9 bar；参考气，CO2；参考气压力，1.3 bar；柱温，65 ℃；色谱柱，PoraPlot Q；离子源电压，2.97 kV；真空度，1.6×10-6mBar；轰击电压，123.8 eV。

1.5 数据处理

Thermo Electron Isodat Version 3.0软件用于同位素比值的计算和数据获取。主成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）采用R语言进行分析。绘图软件采用Origin 9.0（美国，Originlab）进行数据图绘制。

2 结果与讨论

2.1 精密度和准确性

在前期研究中[18]，通过加标回收试验考察ICPMS测定特基拉酒中22种元素的精密度和准确度，各待测元素的加标回收率均处于90%～110%，与前期研究食品中铅、砷、汞、镉、钡、铬、银、镍8种元素的结果一致[19]，表明ICP-MS能满足各元素的检测要求。

根据国际检测方法质量控制要求[20]，质控标准品和样品δ13C值测定偏差分别不超过0.05%和0.03%。通过使用炭黑标准物质和氢氧同位素水标准物质对参考气CO2进行碳同位素和氧同位素标定，如表1所示，参考气CO2的δ13C值测定的标准偏差为0.001 6%，氧同位素比值δ18O测定的标准偏差小于0.006%，满足试验的检测要求。

采用同一个样品重复考察试验方法的准确度。按照试验条件和步骤，同一个样品中乙醇的碳同位素比值用GC-IRMS重复测定8次，同一个样品中水的氧同位素比值用GasBench Ⅱ-IRMS重复测定8次，并计算标准偏差，结果如表2所示，特基拉酒中乙醇的δ13C值和水的δ18O值测定的标准偏差分别为0.012%和0.003%，满足试验准确度要求。

表1 标准物质的δ13C值和δ18O值精密度测定结果*

表2 IRMS测定特基拉酒中乙醇δ13C值和水δ18O值的准确度*

2.2 产地溯源分析

为了检测特基拉酒中多元素含量和碳、氧稳定同位素比值分析在特基拉酒产地溯源中的有效性，选取墨西哥4个法定产区（Jalisco、Guanajuato、Michoacan、Tamaulipas）的特基拉酒，利用该方法分别测定特基拉酒中多元素含量、乙醇的碳同位素比值和水的氧同位素比值。分析结果表明，不同产地特基拉酒的多元素含量（见参考文献中表4）[18]、碳和氧同位素比值（见表3）存在差异，说明特基拉酒的多元素含量、碳和氧同位素比值成分具有产地差别，能用于产地溯源分析。

2.3 模型建立

依据对特基拉酒4个产区的特基拉酒中稳定碳同位素δ13C、氧同位素δ18O的单因素方差分析的结果，以及22种金属元素含量的主成分分析结果，对金属元素得出的6种主成分分析结果进行方差分析，均存在显著性差异，由此可通过产地溯源模型构建，并利用构建的模型进行产地判别。对Guanjuat、Jalisco、Michoaca和Tamaulip 4个产区的44个样品中测定得到稳定同位素和金属元素的数据进行偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA），构建模型，结果见图1和图2。

通过稳定碳、氧同位素和多元素分析可将4个地区的特基拉酒有效分开，但是Tamaulip地区集中在PC1和PC2的负半轴形成的区域，而剩下的3个地区Guanjuat，Jalisco和Michoaca集中在PC1的正半轴的区域内，但是都能分开，效果较好。

表3 特基拉酒中乙醇δ13C和水δ18O测定结果

图1 墨西哥特基拉酒产地鉴别PLS-DA模型的二维图

图2 墨西哥特基拉酒产地鉴别PLS-DA模型的二维图

2.4 模型验证

由表4可以看出，Guanjuat地区的样品1个被误判为Tamaulip地区，预测准确率75%，而其他3个产区均判别准确，预测准确率100%。因此可以看出该模型整体可靠，其模型的总体预测准确率93.75%。可通过继续加大样品采集量，构建更加庞大数据库，争取和墨西哥特基拉酒相关实验室达成技术合作，采集更多关于当地龙舌兰以及特基拉酒更多技术信息，如当地气候资料、当地地表水中氧同位素数据等，构建更加可靠，信息量大，更接近当地真实情况。

表4 墨西哥特基拉酒4个产区溯源PLS-DA模型验证

3 结论

通过对特基拉酒中乙醇的稳定碳同位素δ13C和特基拉酒中水的稳定氧同位素δ18O测定的数据及利用ICP-MS对特基拉酒中22种金属元素的测定结果进行数据分析之后，构建产地模型，总体预测准确率93.75%，由此判定该模型是基本可靠，有待进一步扩大样本量和在技术推广中完善其后续的模型预测产地的精准度的完善与提高。