不同胁迫因子对葡萄皮中白藜芦醇含量的影响

丁华杰，叶云，安欢，赵彬乐，罗容青，钟英英*

广西科技大学生物与化学工程学院（柳州 545006）

葡萄是一种双子叶植物，它不但营养丰富、用途广泛，而且色美、味甜，是果中佳品[1]。研究表明，葡萄果皮中主要有花色素类、白黎芦醇及黄酮类等[2]。白藜芦醇（3, 5, 4-三羟基二苯乙烯），又名芪三酚，是目前研究最为广泛的多酚类化合物之一，白藜芦醇含有多种重要的生物活性物质，它的保健作用和药用价值已受到人们的普遍重视。其具有抗癌[3]、抗炎[4]、改善血管功能[5]、延长寿命、延缓衰老[6-7]等多种药理作用。

白藜芦醇的非生物诱导剂有许多，比如臭氧、紫外线、氯化铝、乙磷铝、过氧化氢、温度等，这些因素有些可以提高白藜芦醇的含量，但有些又可以降低白藜芦醇的含量，具体的影响条件还不是十分清楚。试验以葡萄皮为原料，将果皮晾干备用，通过改变过氧化氢、氯化铝、硝酸银等六个因素，探讨它们对葡萄皮中白藜芦醇含量的影响。通过对葡萄皮中提取白藜芦醇，可以更好地开发葡萄的利用价值，变废为宝，为农产品的开发利用提供一条新思路。

1 试验材料及预处理

1.1 试验材料

试验材料购于广西柳州市潭中市场，葡萄品种为红地球，挑选质地均一、没有病虫害、外观完整、无机械损伤的葡萄。清洗，晾干，剔除果肉，果皮备用。每组处理3次重复。

1.2 试验试剂

白藜芦醇标准品，购于成都曼思特生物科技有限公司；分析纯硝酸银、过氧化氢、盐酸、氢氧化钠，均购于广东光华科技股份有限公司；分析纯氯化铝，购于成都市科龙化工试剂厂。

1.3 材料预处理

1) pH处理：pH的处理参照吕中等[8]的方法，用38%浓盐酸和10 mol/L的氢氧化钠调节pH，使pH为3，5，8，11和13，然后用不同pH的溶液进行浸泡，浸泡1 h。

2) 过氧化氢溶液处理：过氧化氢处理参考Chung等[9]的方法，过氧化氢浓度为1.25%，2.5%，5%和10%，处理方式为浸泡处理，处理1 h。

3) 氯化铝溶液诱导：氯化铝处理参照Adrian等[10]的方法，氯化铝的浓度为1，7，30，60，90和120 μ g/mL，处理方式为酸性溶液浸泡处理，浸泡处理1 h。

4) 硝酸银溶液诱导：硝酸银的处理参考张真等[11]的方法，硝酸银的浓度为1，5，10，15，20和25 μg/mL，处理方式为浸泡处理，处理1 h。

5) 低温诱导：将原料置于-20 ℃冰箱中1 h。

6) 紫外线诱导：紫外线处理参照亓桂梅等[12]的方法，UV（254和310 nm照射60 min）处理原料1 h。

7) 热休克诱导：热休克处理根据热休克反应原理设置温度，设置温度40，50和60 ℃，分别置于这3个温度的烘箱中处理1 h。

2 试验方法

2.1 白藜芦醇的提取

取上述处理过的葡萄皮置于50～60 ℃的烘箱中烘干，分别称取2.00 g置于圆底烧瓶中，加入40 mL乙醇溶液置于磁力搅拌器中提取2 h，趁热过滤，所得滤液置于旋转蒸发仪中回收乙醇直至剩余液体体积约为5 mL，定容至10 mL。在306 nm处测定溶液的吸光度。

2.2 白藜芦醇的含量测定

取少许白藜芦醇置于水浴锅中蒸干，溶于乙醇溶液中，采用薄层色谱法对白藜芦醇进行定性分析[13]。展开剂为正丁醇-醋酸-水（4︰1︰5，V/V），在365 nm的紫外灯下观察荧光。观察对照品溶液和供试品溶液的荧光位置。

2.3 白藜芦醇标准曲线的绘制

精密称取2.00 mg白藜芦醇标准品，用无水乙醇定容至10 mL。配制质量浓度为2，4，6，8，10和12 μ g/mL的对照品溶液，以乙醇作参比溶液，测定306 nm处的吸光度，以浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。按式（1）计算白藜芦醇的含量。

式中：m为白藜芦醇的浓度，μg/mL；V为溶液体积，mL；D为样品稀释倍数；G为样品质量，g。根据公式算出含量，求出三组平行试验的平均值。

3 试验结果与分析

3.1 白藜芦醇标准曲线

如图1所示，白藜芦醇线性回归方程为A=0.184 8C+0.042 3，R2=0.999 1。标准曲线在白藜芦醇浓度0～12 μ g/mL范围内呈线性相关。重复3次，取平均值。

3.2 不同浓度的过氧化氢溶液对白藜芦醇含量的影响

如图2所示，当过氧化氢浓度在0～5%时，白藜芦醇的含量呈直线上升的趋势；当过氧化氢浓度大于5%时，白藜芦醇的含量逐渐降低；当过氧化氢浓度为5%时，白藜芦醇的含量最大，表明过氧化氢浓度的增加，有利于促进葡萄中白藜芦醇含量的累积。该试验结果与田春芳等[14]的研究趋势一致。

图1 白藜芦醇标准曲线

图2 不同浓度过氧化氢对白藜芦醇含量的影响

3.3 不同浓度氯化铝溶液对葡萄皮中白藜芦醇含量的影响

由图3可知，当氯化铝浓度为0～90 μg/mL时，葡萄皮中白藜芦醇的含量逐渐升高；当氯化铝浓度大于90 μg/mL时，葡萄皮中白藜芦醇的含量急剧降低；当氯化铝浓度为90 μg/mL时，葡萄皮中白藜芦醇的含量达到最大。这与黄方爱等[15]得到的研究趋势一致。当氯化铝浓度为90 μg/mL时，最有利于葡萄皮中白藜芦醇的累积。

图3 不同浓度的氯化铝对白藜芦醇含量的影响

3.4 不同浓度的硝酸银溶液对白藜芦醇含量的影响

如图4所示，在0～10 μg/mL范围内，随着硝酸银浓度的增大，葡萄皮中白藜芦醇的含量也逐渐增大；当硝酸银浓度大于10 μg/mL时，葡萄皮中白藜芦醇含量的增加呈现下降的趋势，但其含量还是在增长，但增长比较缓慢；当硝酸银浓度大于10 μg/mL时，白藜芦醇含量的增长明显下滑。这与张真等[11]的研究趋势一致。故最适白藜芦醇累积的硝酸银浓度为10 μ g/mL。

图4 不同浓度的硝酸银对白藜芦醇含量的影响

3.5 热休克对白藜芦醇含量的影响

由图5可知，当温度为25～50 ℃时，葡萄皮中白藜芦醇的含量是上升的；50 ℃时，白藜芦醇的含量最大，是葡萄皮中白藜芦醇累积的最适温度。继续上升温度，葡萄皮中白藜芦醇的含量也是升高的，只是上升的趋势有所减慢。此次试验结果与李景明[16]的研究结果一致，只是在含量上有些许差别。

图5 热休克对白藜芦醇含量的影响

3.6 低温对白藜芦醇含量的影响

从图6可以看出，低温对葡萄皮中白藜芦醇含量有抑制作用，该试验结果与李景明[16]的研究一致，在低温条件下，白藜芦醇的含量都是有所下降的。

图6 低温对白藜芦醇含量的影响

3.7 不同紫外灯波长对白藜芦醇含量的影响

如图7所示，当波长为254 nm时，白藜芦醇的含量相对于对照时白藜芦醇的含量是升高的，而在310 nm时，白藜芦醇的含量相对于对照是降低的。这与刘竹兰等[17]的研究趋势是一致的，说明了此次试验的准确性。

图7 不同波长对白藜芦醇含量的影响

4 结论

试验研究了过氧化氢等六个影响因子对葡萄皮中白藜芦醇含量的影响。碱性条件、过氧化氢浓度为5%、氯化铝浓度为90 μg/mL、硝酸银浓度为10 μg/mL、紫外灯波长为254 nm、热休克的条件，有利于葡萄皮中白藜芦醇含量的增加。而低温则不利于葡萄皮中白藜芦醇的累积。