玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶负载槲皮素纳米颗粒制备

金绍娣，许雪儿，杨静

盐城工业职业技术学院九洲药学院（盐城 224005）

槲皮素（Que）广泛存在于植物的花、叶、果实中，是一种多羟基黄酮类化合物，具有抗氧化清除自由基、抗癌、抗凝血、保护心血管等多种药理活性。然而，槲皮素难溶于水，在酸性碱性、光氧条件下均不稳定，严重限制其在食品和药物领域中的应用[1]。

玉米醇溶蛋白（Zein）作为一种天然的生物大分子材料，不溶于水，能溶于50%～90%乙醇水溶液，溶于高浓度碱液，分子结构含有大量的疏水氨基团和极性氨基团。玉米醇溶蛋白其独特溶解性和特有的两亲性，能够有效制备纳米颗粒，作为食品活性成分和药物输送载体，但因静电斥力易发生聚集，因而影响了应用[2]。阿拉伯胶（AG）是一种具有低蛋白质结构的多支链多糖，能通过非共价键相与蛋白质发生络合，使zein的网络结构得到强化，提高zein的稳定性，提高其耐酸碱盐性[3-5]。

试验通过制备所得zein-AG纳米颗粒对Que进行高效负载，以达到缓释效果，提高其利用率。通过反溶剂法结合AG制备负载Que的zein纳米颗粒，研究玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶的浓度比、玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶与槲皮素质量比、pH、盐离子浓度变化对纳米颗粒稳定性的影响，并对Que的包封率和负载率进行探究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

槲皮素、阿拉伯胶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；玉米醇溶蛋白（苏州嘉叶生物科技有限公司）；氯化钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、无水乙醇、二甲基亚砜（国药集团化学试剂有限公司）；所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器设备

冷冻干燥机（FD18-QX立式型）；台式低速自动平衡离心机（TDZ5B-WS型）；磁力搅拌器（上海精密仪器有限公司）；纳米粒度电位仪（Zetasizer Nano ZS，马尔文仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9023A，北京利辉试验设备有限公司）；紫外可见光分光光度计（UV1801，北京瑞利分析仪器有限公司）；傅里叶红外光谱仪（PerkinElmer Spectrum GX，珀金埃尔默股份有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 zein-AG纳米颗粒制备

参照Zhang[6]的方法，称取0.5 g zein溶于10 mL 80 g/100 mL乙醇溶液中，磁力搅拌30 min，得到质量浓度为100 g/L zein储备液；称取一定量AG溶于10 mL去离子水中，在500 r/min条件下磁力搅拌1 h得到AG储备液；量取400 μ L zein储备液呈细流状移至39.0 mL的去离子水中，移取600 μL AG储备液至去离子水中，磁力搅拌60 min，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，得zein-AG纳米颗粒分散液，待后续试验。

1.3.2 负载Que的纳米颗粒制备

取800 μL 1.3.1制备好的Que-zein储备液移至去离子水中，移取200 μL AG储备液至去离子水中，搅拌1 h，以3 000 r/min离心10 min后，取上清液得Que-zein-AG纳米颗粒[7]。

1.3.3 不同AG质量浓度比zein-AG纳米颗粒粒径、电位、PDI测定

将分别称取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8和0.9 g AG溶于10 mL 80 g/100 mL乙醇溶液中，磁力搅拌1 h得到质量浓度为10，20，30，40，50，60，70，80和90 g/L的AG储备液，按照步骤1.3.1制成zein-AG纳米颗粒，稀释10倍后，利用纳米粒度电位仪分别测定其平均粒径、ζ-电位及颗粒多分散性（PDI）。

1.3.4 不同Que与zein-AG质量比纳米颗粒粒径、ζ-电位、PDI测定

制备Que与zein-AG不同质量比（1︰1，1︰2，1︰4，1︰6，1︰8，1︰10，1︰20，1︰40，1︰60，1︰80和1︰100）的纳米颗粒，分别取1 mL不同含量的Que/zein-AG纳米颗粒，稀释10倍，分散均匀，上机测定。

1.3.5 不同pH下纳米颗粒粒径、ζ-电位、PDI测定

用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调节样品pH至2～12，分别取不同pH纳米颗粒1 mL，稀释10倍，测定其粒径、电位及PDI。

1.3.6 不同盐离子强度下纳米颗粒粒径、ζ-电位、PDI测定

取5 mL现制的纳米颗粒，分别加入50～100 mmol/L不同浓度的氯化钠溶液，搅拌均匀，静置30 min。分别取1 mL不同氯化钠浓度的纳米颗粒，稀释10倍，待后续试验。

1.3.7 Que包封率和负载率测定

参照Donsi等[8]的方法并稍作改动，移取10 mL负载Que的纳米颗粒、10 mL二甲基亚砜置于烧杯中，搅拌1 h，萃取得游离的Que，用0.22 μm有机膜过滤，重复萃取3次，合并萃取液用二甲基亚砜稀释10倍，以二甲基亚砜作为空白对照，于槲皮素特征吸收峰λ=375 nm处测定样品的吸光度，根据Que在乙醇中标准曲线线性回归方程：y=0.006 5+0.009x，r=0.999 5。计算游离槲皮素含量，根据（1）得出槲皮素包封率，式（2）计算槲皮素负载率。

1.3.8 傅立叶变换红外光谱分析

采用衰减全反射法，Que、zein/Que纳米颗粒、zein-AG/Que纳米颗粒分别经压片后傅立叶变换红外光谱分析，波数范围4 000～550 cm-1，分辨率2 cm-1，扫描4次。

2 结果与分析

2.1 不同AG质量浓度下zein-AG纳米颗粒粒径、PDI、电位值

zein-AG纳米颗粒粒径、PDI随AG质量浓度变化如图1（a）所示，AG质量浓度10～30 g/L，zein-AG纳米颗粒聚集，分散液有明显沉淀现象，PDI值均为1；AG质量浓度40～90 g/L内，聚集减轻，粒径、PDI值随浓度增加而降低，50 g/L以上呈稳定态，粒径在210～380 nm，PDI值在0.3～0.6；纳米颗粒电位随AG质量浓度变化如图1（b）所示，测得zein纳米颗粒带正电荷（+35 mV），AG质量浓度10 g/L时，体系电位下降至+0.75 mV，表明阿拉伯胶与玉米醇溶蛋白表面的正电荷发生静电作用；AG质量浓度增加到20 g/L时，更多的阿拉伯胶分子吸附到颗粒表面，电位值为-12.2 mV，纳米颗粒带负电荷；AG质量浓度50～90 g/L，阿拉伯胶溶液达到饱和，纳米颗粒处于稳定。由图1的粒径、PDI、电位可知，制备zein-AG纳米颗粒时，应选取50 g/L的AG质量浓度为最佳。

2.2 不同Que与zein/AG质量浓度比下纳米颗粒粒径、PDI、电位值

纳米颗粒粒径、PDI随与Que质量浓度变化如图2（a）所示，在1︰1～1︰10范围内，随着zein-AG纳米颗粒质量浓度增高，粒径变小；大于1︰10时，粒径、PDI均较为稳定，纳米颗粒粒径在161.1 nm左右，PDI也在0.25左右，zein-AG与槲皮素通过非共价相互作用，将其完全包住在纳米颗粒内；电位随与Que质量浓度变化如图2（b）所示，随着zein-AG质量浓度比例增大，电位随之下降；1︰10～1︰80时，电位下降但变化无显著性差异，在-35 mV左右，与Wu等[9]研究结果一致，饱和负载物的纳米颗粒之间因负电荷的静电斥力及多糖分子覆盖后形成的空间位阻作用保持稳定。

图1 不同AG质量浓度对zein-AG纳米颗粒粒径、PDI、电位的影响

图2 不同Que与zein-AG质量浓度比对纳米颗粒粒径、PDI、电位值的影响

2.3 不同pH纳米颗粒粒径、PDI、电位值

纳米颗粒的粒径与PDI随pH的变化如图3（a）所示，pH 3～4内，粒径随之增加而减小（210.3和163.1 nm）时，阿拉伯胶有足够的负电荷与zein颗粒结合，静电吸引增强；pH 5～10内，在122.5～163.2 nm，呈稳态，PDI值均在0.3～0.4，无明显变化。纳米颗粒的电位随pH的变化关系见图3（b），电位随pH升高而降低，体系pH 3～4时，电位较低（-18.5和-19.1 mV），pH 5～10时，复合纳米颗粒表面净负电荷增加，电位保持在-30 mV左右。纳米颗粒在广泛的pH变化下能较好维持体系稳定，粒状均一，相比zein颗粒在等电点（pH 6.2）附近因疏水作用发生严重聚集的现象有明显改善。黄旭琳[10]研究的果胶复合玉米醇溶蛋白纳米颗粒在pH 3.0以下因果胶分子的空间位阻作用而稳定，高于pH 3.0因纳米颗粒之间静电斥力增强，稳定性增加的结果与试验结果一致。

图3 不同pH对纳米颗粒粒径、PDI、电位值的影响

2.4 不同盐离子强度纳米颗粒粒径、PDI、电位值

纳米颗粒粒径、PDI、电位随盐离子强度变化如表1所示，氯化钠浓度0～30 mmol/L内，粒径、PDI随之增加逐渐增加，颗粒粒径平均在210 nm左右，低强度盐离子时纳米颗粒体系较为稳定；氯化钠浓度50 mmol/L时，分散液的外观变得混浊，粒径明显增加，浓度达到90 mmol/L时，纳米颗粒聚集严重，发生沉淀。同Huang等[11]研究结果相似，高浓度的盐离子会中和多糖及蛋白分子表面的大量电荷，降低zein与AG之间的静电作用。

表1 不同盐浓度对纳米颗粒粒径、PDI、电位值的影响

2.5 不同Que与zein-AG质量浓度比下槲皮素包封率和负载率

包封率、负载率随Que与zein-AG质量浓度比变化由表2可知，随着zein-AG纳米颗粒浓度增大，体系包封率、负载率逐渐增加，在Que与zein-AG质量浓度比大于1︰20时，包封率逐渐增大至89.1%，负载率至18.62%，此时纳米颗粒体系中zein-AG达到饱和，能够把槲皮素包埋在纳米体系内，其结果与2.2一致，也与殷婷等[12]研究大麦醇溶蛋白负载白藜芦醇自组装纳米颗粒包封率为90.4%，载药率达到18.8%报道一致。

表2 不同Que与zein-AG质量浓度比槲皮素包封率和负载率影响

2.6 傅立叶变换红外光谱测试

Que的红外光谱图如图4A，3 481 cm-1处是酚羟基（—OH）吸收峰；1 737 cm-1处是碳氧键（—C＝O）伸缩振动峰；1 567和1 484 cm-1这2个峰为苯环（—C＝C—）骨架振动吸收峰；1 305 cm-1为—C—O—C面内变形振动峰，结果与玛丽哈巴·拜克来[13]表征一致。zein/Que纳米颗粒的红外光谱图如图4B所示，3 529 cm-1处为蛋白质氮氢键振动峰；1 833和1 737 cm-1这2个峰分别为蛋白质酰胺I带（C—O）和酰胺Ⅱ带（C—N和N—H）[14]。zein-AG/Que纳米颗粒的红外光谱图如图4C所示对比zein/Que纳米颗粒（图2B）可知，在复合纳米颗粒中氢键发生红移至3 501 cm-1，槲皮素与蛋白之间存在的静电相互作用，槲皮素—OH吸收带被完全掩盖，—C＝O伸缩振动吸收带也偏移至1 808 cm-1，表明阿拉伯胶与蛋白质形成新的氢键络合，其特征峰几乎都发生偏移、强度降低。

图4 Que、zein/Que纳米颗粒、zein-AG/Que纳米颗粒傅里叶红外光谱图

3 结论

通过优化AG浓度制备zein-AG载体，考察槲皮素/玉米醇溶蛋白-阿拉伯胶质量比、pH、盐离子强度对运载体系稳定性的影响，制备得到zein-AG/Que纳米颗粒。研究发现复合AG的zein纳米颗粒的稳定性增强，耐盐耐酸碱性，可作为槲皮素的有效输送载体，改善其生物活性利用度。