胃癌组织中miR-133a-3p、miR-4317的表达及临床意义

杨建华，牛广旭，郭晓娟，王 静

(河北省邯郸市中心医院病理科，河北邯郸 056001)

胃癌是人类最常见的癌症类型之一，是仅次于肺癌的第二大肿瘤死亡原因，每年新增胃癌患者达93.4万例[1]，我国胃癌致死病例占全世界胃癌致死总数的40%左右[2]。不同胃癌患者的早期症状各不相同[3]，胃癌常在晚期诊断，伴有恶性增生和转移[4]。尽管目前胃癌的化疗和分子靶向治疗取得了进展，但对晚期胃癌患者的预后仍然不利，胃癌的5年生存率低于25%[5-6]。因此，寻找一种能够在早期预测和术后预警胃癌患者生存的检测指标具有重要的临床意义。微小RNA(miR)是一种长度为19～24个核苷酸的单链非编码RNA，它参与人类近1/3基因的表达调控，在发育时序的控制、细胞周期调控、细胞凋亡等方面发挥着重要的作用[7]。miR-133a在食管癌[8]、膀胱癌[9]、结直肠癌[10]等多种肿瘤中存在异常表达，并在肿瘤的侵袭、转移、增殖、凋亡及药物耐药方面发挥重要的调节作用。有研究发现，miR-133a在胃癌中表达也存在显著异常，并抑制胃癌的发生、发展[11]；miR-133a-3p在胃癌的发生和发展过程中发挥重要作用，有研究报道miR-133a-3p能够抑制胃癌细胞SGC7901的增殖和迁移[12]。miR-4317位于18p 11.31，是一种新发现的miR，在黑色素瘤[13]和非小细胞肺癌[14]等多种肿瘤中均有异常表达。miR-133a-3p和miR-4317在胃癌患者中均表现为异常表达，并且二者与胃癌的发生和发展有着密切的关系，然而目前临床上关于胃癌中miR-133a-3p和miR-4317的研究以及二者与胃癌患者的临床特征间的关系研究较少。因此本研究主要通过分析miR-133a-3p和miR-4317在胃癌组织表达水平，探讨二者与胃癌患者的预后、临床特征的关系，为胃癌的预测和预后判定提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2010年4月到2012年3月入住本院的60例胃癌患者的胃癌组织标本(非坏死部分)及其相应的癌旁正常组织标本(距离≥5 cm癌旁正常组织)。纳入标准：病理学诊断为胃癌，采用手术切除(根治术或姑息性手术)，患者术前未进行任何放疗和辅助治疗，临床资料及随访资料完整，签署知情同意书；排除标准：合并其他恶性肿瘤，术前已接受抗肿瘤治疗者，患全身感染性疾病、肝肾疾病者。本研究60例胃癌患者年龄21～75岁，<60岁患者33例，≥60岁患者27例；男性患者45例，女性患者15例；低分化患者28例，中高分化患者32例；淋巴结转移患者35例，无淋巴结转移患者25例；浸润深度：黏膜下各层23例，浆膜层37例；有远处转移44例，无远处转移16例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期26例，Ⅲ+Ⅳ期34例。本研究经医院伦理委员会审核同意。

1.2方法

1.2.1组织RNA提取及实时荧光定量反转录PCR(RT-qPCR)试验 Trizol试剂(Takara公司)提取来自组织中的总RNA。反转录试剂盒(Takara公司)对mRNA进行反转录。RT-qPCR使用试剂盒SYBR Green PCR Kit(Takara公司)。反应条件如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，共45个循环。U6引物为miR-4317和miR-133a-3p内源性对照。所用特异性引物序列如下：miR-133a-3p正向引物为5′-CGA GCC TTT GGT CCC CTT CAA C-3′，miR-133a-3p反向引物为5′-TCA ACT GCT GGT GTC GTG GAG TCG GC-3′；miR-4317正向引物为5′-ATC CAG TGC GTG TCG TG-3′，miR-4317反向引物为5′-TGC GT C ACA TTG CCA GG-3′；U6正向引物为5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，U6反向引物为5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′；2-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.2.2随访 采用电话或者门诊复查的方式对患者进行随访，每3个月随访1次，随访时间为确诊后1～60个月，直至患者死亡或者截止随访时间。

2 结 果

2.1不同胃组织中miR-133a-3p与miR-4317的表达 RT-qPCR试验结果显示，胃癌组织中miR-133a-3p、miR-4317相对表达量均低于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 miR-133a-3p、miR-4317在不同胃组织中相对表达量比较

2.2胃癌组织中miR-133a-3p与miR-4317表达与患者临床特征的关系 胃癌组织中miR-133a-3p表达水平与肿瘤TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05)，而与患者年龄、性别、分化程度、浸润深度、远处转移无关(P>0.05)；miR-4317表达水平与淋巴结转移、远处转移及肿瘤TNM分期有关(P<0.05)，而与患者年龄、性别、浸润深度、分化程度无关(P>0.05)。见表2。

表2 胃癌组织中miR-133a-3p和miR-4317表达与患者临床特征的关系

图1 miR-133a-3p与患者预后的Kaplan-Meier生存曲线

2.3miR-133a-3p和miR-4317表达与患者预后的关系 (1)miR-133a-3p表达对预后的影响：以miR-133a-3p中位数(0.34)为界，将胃癌患者分为miR-133a-3p高表达组(n=30)和miR-133a-3p低表达组(n=30)。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，miR-133a-3p高表达组与低表达组术后5年生存率为26.67%(8/30)和20.00%(6/30)，术后生存时间为(27.57±2.55)个月和(20.80±2.30)个月，两组之间生存率差异有统计学意义(Log Rankχ2=17.920，P=0.001)，见图1。(2)miR-4317表达对预后的影响：以miR-4317表达量中位数(0.49)为界，将胃癌患者分为miR-4317低表达组(n=30)和miR-4317高表达组(n=30)。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，miR-4317高表达组与低表达组术后5年生存率为30.00%(9/30)和16.67%(5/30)，术后生存时间为(32.97±2.56)个月和(24.51±2.55)个月，两组生存率差异有统计学意义(Log Rankχ2=21.130，P=0.001)，见图2。

图2 miR-4317与患者预后的Kaplan-Meier生存曲线

3 讨 论

胃癌是目前我国最为常见的恶性肿瘤之一，主要来自胃黏膜上皮的恶性肿瘤，手术切除是目前胃癌治疗的主要手段，但是，由于胃癌在早期阶段无明显的临床症状，因此，大多数患者确诊时已经处于癌症晚期，所以预后较差[15]。在中国，胃癌仍然是一个沉重的负担，对这种疾病没有有效的治疗方法，准确预测胃癌患者的预后对于胃癌患者的治疗是非常重要的。到目前为止，TNM分期、淋巴结转移、临床分期等特征在临床应用中，对预测胃癌患者的预后，指导个体治疗有重要意义[16]。然而，这些特征的应用还不能够满足临床需求。目前人们对miR的研究越来越多，研究认为，一些miR具有预测胃癌和预后生物标志物的潜力，例如miR-335-5p，miR-558和miR-145-5p[17-19]。因此寻找特异性的早期预测标志物，能够早期预测和术后预警胃癌患者生存的检测指标具有重要的临床意义。

miR是一类高度保守的非编码RNA分子，在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要的作用，可以作为肿瘤分子的标志物，在肿瘤的早期预测和治疗过程以及患者的预后判断中发挥重要的作用[7]。很多癌症如肺癌、乳腺癌、前列腺癌等，肿瘤组织和正常组织对比，miR存在差异性表达[20-22]。miR-133序列首次在小鼠上被发现，人类基因组中有3个已知的miR-133：miR-133a-1、miR-133a-2和miR-133b[23]。有研究通过对TCGA数据库进行miR-Nomes分析发现miR-133a家族在胃癌中表达均为下调趋势，并且通过SGC-7901、MNK-45胃癌细胞系和原发胃癌组织进行验证，证实了该结果，表明miR-133a在胃癌的发生和发展过程中发挥重要作用[24]；miR-133a-3p在胃癌中表现为异常表达，有研究证明miR-133a-3p能够通过靶向调控Mcl-1和Bcl-xL促进细胞发生凋亡[25]。miR-4317位于18p11.31，是一种新发现的miR，目前，已有一些研究报道了miR-4317在几种肿瘤中的表达模式和生物学功能[12-13]。在非小细胞肺癌中，miR-4317表现为低表达，同时miR-4317高表达与肺癌晚期临床分期有关，具有较好的总体生存率，miR-4317表达可以通过靶向成纤维细胞生长因子9来抑制细胞的增殖和转移[13]。另一方面，在胃癌中，miR-4317表达也表现为下调，其高表达可以通过靶向ZNF 322来抑制人胃癌细胞的增殖[14]。

本文通过RT-qPCR验证miR-133a-3p和miR-4317在60例胃癌组织和对应的癌旁正常组织中表达水平，发现相对于癌旁正常组织，miR-133a-3p和miR-4317在胃癌组织中表达均显著下调。同时通过对胃癌患者的临床特征进行分析，结果显示miR-133a-3p表达水平和TNM分期、淋巴结转移有关，而与患者的年龄、性别以及分化程度、浸润深度和远处转移无关。在胃癌组织中，当miR-133a-3p表现低表达时，患者发生明显淋巴结转移，并且具有较晚的分期；以上结果表明miR-133a-3p在胃癌的发生和发展中主要发挥抑癌的作用，它的高表达与肿瘤的恶性程度有关。同时预后显示，miR-133a-3p高表达的患者具有较好的预后和较高的术后生存率，可以作为判断患者预后情况的一项指标。miR-4317表达水平和远处转移、TNM分期、淋巴结转移存在有关，而与患者年龄、性别和浸润深度以及分化程度无关。miR-4317表达下调时，胃癌患者容易发生远端转移，并且发生明显的淋巴结转移，肿瘤具有较晚的分期；表明miR-4317在胃癌的发生和发展中主要发挥抑癌功能，同样它的高表达与肿瘤的恶性程度有关。同时预后显示，miR-4317高表达的患者具有较好的预后和较高的术后生存率，可以作为判断患者预后情况的一项指标。

在胃癌的发生和发展过程中，miR-133a-3p和miR-4317可能发挥着癌基因的功能，miR-133a-3p和miR-4317的高表达能够抑制胃癌的肿瘤形成和恶性进展过程，且均与患者的不良预后密切相关。因此miR-133a-3p和miR-4317很可能作为胃癌预测和预后判断的潜在靶点。

4 结 论

本研究表明，miR-133a-3p和miR-4317在胃癌中的表达均明显下调，并与胃癌的进展和预后不良有关，提示其可能作为胃癌预测的潜在生物标志物和治疗靶点。