肛门区鳞状细胞癌和鳞状上皮内瘤变组织中HPV感染型别的研究*

季月霞,武晓雷,耿建祥△,仲玉英,吴 冲,吴昆岚,张金浩,梅 静,赵 雪

(1.南京中医药大学常熟附属医院病理科,江苏常熟 215500；2.南京中医药大学附属南京中医院病理科,江苏南京 210022)

肛门区鳞状细胞癌的发病率在一般人群中为1/10万,是一种比较少见的恶性肿瘤,过去20～30年,美国男性和女性肛门区鳞状细胞癌的发病率分别增加96%和39%。男性同性恋者(MSM)肛门区鳞状细胞癌的发病率据估计为35/10万。人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的MSM发生肛门区鳞状细胞癌的风险可能是非HIV感染MSM的2倍。有肛门性交的男性人群发病率比一般人群高,性行为的方式是导致肛门区鳞状细胞癌发病率上升的重要因素之一。有研究发现,90%左右的肛门区鳞状细胞癌与高危型人乳头瘤病毒(HRHPV)感染密切相关,宫颈部位和肛门部位在人乳头瘤病毒(HPV)感染的型别上高度一致,这意味着肛门部位与宫颈部位具有共同的感染来源[1-4]。国内文献中少见关于肛门区鳞状细胞癌及肛门区上皮内瘤变(AIN)组织感染HPV的研究报道。为了进一步了解我国肛门区鳞状细胞癌及AIN组织中的HPV感染及型别分布情况，笔者对28例肛门区鳞状细胞癌及20例低级别和34例高级别AIN患者的发病年龄及HPV感染型别的分布进行了分析,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年于南京中医药大学附属南京中医院全国肛肠医疗中心治疗的5例外痔及5例混合痔患者，女5例，男5例；患者年龄25～68岁，平均50.12岁，收集上述人群肛门周围正常的鳞状上皮石蜡组织标本。选取1995年1月至2018年12月于南京中医药大学附属南京中医院以及南京中医药大学常熟附属医院就诊的肛门区鳞状细胞癌及AIN患者，其中肛门区鳞状细胞癌28例，女13例、男15例,病变发生于肛管的15例、肛缘的13例,患者年龄40～86岁、平均61.96岁；低级别AIN 20例，女6例、男14例,发生于肛管的7例、肛缘的13例,患者年龄24～68岁、平均43.85岁；高级别AIN患者34例,女19例、男15例,发生于肛管的9例、肛缘的25例,患者年龄23～86岁、平均48.27岁。收集上述人群的石蜡组织标本，由2位年资较高的主治医师级别以上的病理科医师按照WHO(2014年)组织学消化道肿瘤的分类标准进行组织切片病理结果复核。

1.2仪器与试剂 基因扩增仪为Gene Amp PCR system 2400型；分子杂交仪为江苏省兴化市分析仪器厂生产的FYY-3型；高速冷冻离心机为Eppendorf公司生产的5810 R型；生物安全柜为江苏省苏州市安泰空气技术有限公司生产的BHC-1300ⅡA2型；青岛海尔有限公司生产的-20 ℃冰箱等。HPV基因分型检测试剂盒由亚能生物技术(深圳)有限公司提供。显色液须新鲜配制，使用时所需水平通过加蒸馏水配制。

1.3方法

1.3.1标本的采集 先去除每例石蜡组织周边多余的石蜡,将石蜡组织切成4 μm厚的切片,切3～5片石蜡组织即可。用专用的镊子轻轻夹取,放入小离心管中,切第2例石蜡组织前,用次氯酸钠溶液擦刀片及镊子各3次。

1.3.2DNA的提取 将切下的石蜡组织片放入1.5 mL离心管中,加入裂解液150 μL,充分振荡混匀,两者均在金属浴中加热100 ℃ 10 min,立即13 000 r/min离心10 min后,取中间层DNA溶液待用。PCR扩增、杂交、孵育和显色按说明书进行规范操作。每份标本显色后根据杂交信号的有无来判断结果。

1.4统计学处理 正常的肛门区周围的鳞状上皮组织、肛门区鳞状细胞癌及AIN组织HPV检出率及各HPV型别的比例采用HPV分型统计软件(南京倍宁医疗器械有限公司提供)进行分析,对分析出来的相关数据,应用统计软件包SPSS13.0对相关数据进行统计学处理,计数资料以百分率表示，百分率的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

10例肛门周围正常的鳞状上皮组织中HPV阳性者1例,总检出率为10.00%(1/10),其中1例为单型感染者(HPV11型)。20例低级别AIN,34例高级别AIN及28例肛门区鳞状细胞癌组织中HPV阴性者、阳性者、总检出率,单型、多型、低危型、高低危型、高危型感染者例数及百分比见表1。肛门区鳞状细胞癌中总的HPV检出率为82.14%(23/28),其中HRHPV检出占100.00%(23/23)；20例低级别AIN总的HPV检出率为55.00%(11/20),其中HRHPV占45.46%(5/11)；34例高级别AIN总的HPV检出率为79.41%(27/34),其中HRHPV占85.19%(23/27)。HPV各型别感染分布情况见表2。

表1 3种肛门病变组织的HPV感染情况[n(%)]

肛门区正常的鳞状上皮组织中HPV总检出率与低级别及高级别AIN组织和肛门区鳞状细胞癌组织中HPV总检出率比较,差异有统计学意义(P<0.05)；低级别与高级别AIN组织中HPV总检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)；低级别AIN与肛门区鳞状细胞癌组织的HPV总检出率比较,差异有统计学意义(P<0.05)；高级别AIN组织和肛门区鳞状细胞癌组织的HPV总检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 3种肛门病变组织的HPV感染型别分布(n)

注:对于多重感染者,各型别的阳性重复计算;/表示无该型别的感染。

3 讨 论

肛门区鳞状细胞癌是发生于中年人的一种少见但发病率正在不断上升的上皮性恶性肿瘤。每年肛门区癌发病率在异性恋人群中约为1/10万,在行肛门性交的男性群体中其发病率明显增高。根据肛门区癌发生的部位可分为肛管癌与肛缘癌两类,大约占下消化道恶性肿瘤的4%。肛门区癌最常见的组织学类型是鳞状细胞癌,其他少见的组织学类型包括腺癌、移行细胞癌、基底细胞样癌或黏液表皮样癌[1]。本文报道的82例患者是常见的肛门区病变,即28例鳞状细胞癌及54例AIN。HPV有许多不同的型别。目前，根据HPV致病性的差异性将HPV分为两大类。一类为低危型HPV:主要引起肛门区及外生殖器皮肤的疣类病变或宫颈和肛门区低级别AIN,其型别主要有6、11、30、42、43、44型等。另一类为HRHPV:可诱发生殖器癌、宫颈癌、肛门区鳞状细胞癌及宫颈和肛门区高级别AIN,主要型别有16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73型等,其中16和18两型感染率最高[1,5-8]。随着肛门区HPV感染率的增加,肛门区鳞状细胞癌及癌前病变发生率也随之上升，应引起人们的关注。

本研究显示，从肛门区正常的鳞状上皮到低级别和高级别AIN,再到肛门区鳞状细胞癌,HPV的总检出率逐步增加,说明HPV感染与肛门区鳞状细胞癌和AIN的发生、发展有着密切的关系。

本研究低级别AIN中HRHPV检出率为45.46%、高级别AIN中HRHPV检出率为85.19%,肛门区鳞状细胞癌中HRHPV检出率为100.00%。这与WONG等[9]报道的AIN低级别病变中HRHPV检出率为56.00%，高级别病变中HRHPV检出率为88.00%,肛门鳞状细胞癌中HRHPV检出率为89.00%比较,虽然HRHPV检出率都随着病变程度的增加而增加,但HRHPV检出率略有差异,这可能与HPV DNA的提取方法、检测的方法、检测试剂型别的覆盖面,检测的最低拷贝数以及组织蜡块保存的条件和时间不同有着一定的关系。低级别AIN中HPV检出率以低危型HPV为主,其次是高低危型HPV,最后为HRHPV,高级别AIN中HPV检出率以HRHPV为主,其次是高低危型HPV,最后为低危型HPV,肛门区鳞状细胞癌中HPV均为HRHPV,提示HRHPV感染是肛门区鳞状细胞癌及大多数高级别AIN的诱发因子。

28例肛门区鳞状细胞癌HPV型别检出频次前5位的为16、31、18、52、58型。20例低级别AIN中HPV型别检出频次前5位为6、11、16、52、31、33型；34例高级别AIN中HPV型别检出频次前5位为16、6、11、52、33型。28例肛门区鳞状细胞癌组织中未出现低危型HPV,全部都是HRHPV,而低级别和高级别AIN中前5位检出频次的HPV型别中除HRHPV外,有两种低危型HPV,说明HRHPV是致肛门区鳞状细胞癌最主要的型别。16型在正常肛门区鳞状上皮中未检测出,低级别AIN中16型排名第3位,高级别AIN及肛门区鳞状细胞癌16型排名均上升到第1位,在肛门区鳞状细胞癌中16型检出率39.29%(11/28),在高级别AIN中16型检出率35.29%(12/34),均是两者所有高危型检出率最高的型别。因此,高危16型是肛门鳞状细胞癌和高级别AIN中最主要的致癌、致瘤型别,因此,临床肛肠科和皮肤科医师对感染了高危16型的低级别AIN患者应给予密切观察,对感染了高危16型的高级别AIN及肛门区鳞状细胞癌除切除病灶外,应定期复查HRHPV并密切随访,以防病变复发。

从发病年龄来看,肛门区鳞状细胞癌患者中位发病年龄为61.96岁,而低级别AIN患者中位发病年龄为43.85岁,高级别AIN患者中位发病年龄为48.27岁,低级别和高级别AIN是肛门区鳞状细胞癌的前期病变,与肛门区鳞状细胞癌患者中位发病年龄比较相差13～18岁。男、女40岁以上均逐步进入肛门区鳞状细胞癌发病的高峰阶段,这与宫颈癌患者发病呈现出年轻化的趋势有所不同[10-11]。可以考虑将40岁以后的高危人群作为肛门区鳞状细胞癌的筛查人群,对他们开展HRHPV检测,如果HRHPV阳性,建议行细胞学及P16/Ki-67双染检查。如细胞学及P16/Ki-67双染检查有一项阳性,建议行肛门镜检查,必要时活检,根据活检报告,确定下一步治疗方案。如细胞学及P16/Ki-67双染检查都阴性,而高危16型HPV检测阳性感染者,也应对其进行跟踪随访观察。

总之,随着自然人群中HPV感染率的增加,肛门区鳞状细胞癌的发病率呈现出逐年增加的趋势,目前,肛门区鳞状细胞癌的发生率还相对较低,但近年来,该病在两性群体中的发生率正以每年约2%的速度逐年递增。男男同性恋及HIV检测阳性者,患AIN及肛门区鳞状细胞癌的风险较高。因肛门区癌与宫颈癌具有相同发病因素,女性如为宫颈癌或宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅲ级病变者发生肛门区癌的风险性明显增加,进一步提示这两种癌具有共同的致病因素,即高危型持续性HPV感染所致[10-12]。年龄在40岁以上的HPV16型感染者发生肛门区鳞状细胞癌的可能性最高,而宫颈高危型HPV阳性的女性,肛门部位感染高危型HPV的风险高出一般女性3倍以上。在高危人群中检测HPV DNA,特别是检查HRHPV、细胞学和P16/Ki-67双染,对发现高级别AIN非常有用,值得在临床上推广[13]。对高危人群——男男同性恋及HIV检测阳性者、年龄在40岁以上的HPV16型感染者及宫颈高级别CIN有HRHPV阳性的女性,开展以高危型HPV、细胞学及P16/Ki-67双染检查是非常必要的,这样肛肠科和皮肤科医师就可有的放矢地对高风险患者实行重点检测和随访,以便尽早地发现AIN患者,把疾病阻止在癌前病变阶段,造福于广大肛门区鳞状细胞癌的患者[2-4,14-16]。

4 结 论

HRHPV感染与高级别AIN及鳞状细胞癌的发生、发展密切相关,对高危人群开展肛门区HRHPV检测、细胞学和P16/Ki-67双染检查,有利于肛门区癌前病变患者实现早诊、早治。