长鳍金枪鱼多肽制备及其对H2O2诱导的张氏肝细胞的保护作用

艾杨洋 丁国芳，2* 杨最素 余方苗 唐云平 陈 艳 黄芳芳

（1 浙江海洋大学食品与医药学院/浙江省海洋生物医用制品工程技术研究中心 浙江舟山316022 2 浙江省海洋水产研究所 浙江舟山316021）

长鳍金枪鱼（T.alalunga），别名长鳍鲔，属脊索动物门（Chordata），辐鳍鱼亚纲（Actinopterygii），鲈形目（Perciformes），鲭科（Scombridae），金枪鱼属（Thunnus）[1]。长鳍金枪鱼为大洋中上层洄游性鱼类，广泛分布于全世界温带及热带海域，我国沿海亦有少量分布。其营养价值较高，鱼肉中粗蛋白含量达到90%以上[2]。随着远洋渔业的快速发展，金枪鱼年产量达到约600 万t，其中长鳍金枪鱼的年产量约占全球金枪鱼产量的7%。金枪鱼鱼肉一般加工成罐头、鱼松等产品，而鱼头、鱼皮、鱼骨等废弃物在总质量中占50%～70%[3]。这些废弃物常被加工成鱼粉等作为饲料或肥料处理，其附加值较低。将废弃物作为海洋功能食品的开发，对于海洋资源的再利用及环境保护具有重要意义。本研究以长鳍金枪鱼废弃物作为原料，通过酶解法提取活性多肽，作用于经H2O2诱导的张氏肝细胞（Chang liver），以相对增殖率 （relative growth rate，RGR）及肝损伤的检测指标等为依据，探讨该多肽是否对损伤的张氏肝细胞具有保护作用，为长鳍金枪鱼多肽（T.alalunga polypeptide，TAP）的研发提供试验依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

长鳍金枪鱼废弃物，宁波今日食品有限公司；张氏肝细胞，中南大学湘雅医学院细胞库；H2O2，DMSO，国药集团化学试剂有限公司；异丙醇，上海生物工程有限公司；NaHCO3，上海虹光化工厂；DMEM，Gibco 公司；胎牛血清，杭州四季青生物制品有限公司；MTT，Sigma 公司；胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶，亚太恒信生物科技有限公司；青霉素、链霉素，山东鲁抗医药股份有限公司；AnnexinV-FITC/PI 双染试剂盒，凯基生物工程有限公司；所用试剂盒包括丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乙醇脱氢酶（ADH），南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

PHS-250 pH 计，上海理达仪器厂；Spectra-Max M2 多功能酶标仪，美谷分子仪器（上海）有限公司；Forma3111 CO2细胞培养箱，杭州宝城生物科技有限公司；CF16RXП日立低温离心机，日本日立公司；ALPHA 1-4/LD plus 冷冻干燥机，德国Christ ALPHA 公司；超净台ZHJM-C12090，上海智城分析仪器制造有限公司。

2 方法

2.1 长鳍金枪鱼多肽的制备

2.1.1 金枪鱼废弃物预处理 将金枪鱼废弃物常温解冻，冲洗，沥干，放入绞碎机中搅碎直至糊状，在50 ℃下用异丙醇脱脂6 h，清洗。

2.1.2 张氏肝细胞损伤模型的制备 通过MTT法检测H2O2在300～1 000 μmol/L 不同浓度梯度下对张氏肝细胞的损伤情况，以细胞的存活率为80%左右为标准，确定H2O2的最佳浓度。

2.1.3 MTT 法测细胞相对增殖率 将张氏肝细胞以细胞密度1×105个/mL 接种至96 孔板中，设加药组、模型组、正常组和空白对照组。经24 h 贴壁后，加药组加入质量浓度为0.25 mg/mL 的样品。培养12 h 后，加药组和模型组加入终浓度为600 μmol/L 的H2O2损伤。作用4 h 后弃液，加入MTT继续培养4 h。培养箱中取出，加入150μL DMSO溶解，振荡10 min 后，放置于多功能酶标仪490nm 处测定吸光度[4]。

（Relative Growth Rate，RGR）%=（A1-A2）/A2×100

式中：A1——加药组吸光度；A2——模型组吸光度。

2.1.4 最佳酶种选择 各取5 g 预处理后的样品，参照文献[5]中碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的最适酶解温度及pH 值，在固定条件下取加酶量1 000 U/g，酶解时间4 h，料液比1∶5（g/mL）为酶解条件。酶解完毕后灭活15 min，离心机12 000 r/min 下离心15 min，取上清液，MTT 法测其对H2O2诱导的张氏肝细胞细胞损伤的相对增殖率，从而获得最佳酶种。

表1 不同酶的最适酶解温度和pH 值Table 1 The optimum temperature and pH of the different enzymes

2.1.5 酶解条件优化 在确定了最佳的蛋白酶种之后，设计5 因素4 水平的正交试验表，正交试验设计见表2。同样采用MTT 法，以细胞的相对增殖率为指标，确定最佳酶解条件。

表2 单因素试验因素与水平表Table 2 Level of orthogonal experimental factors

2.1.6 长鳍金枪鱼多肽的分离 纯化最佳酶解条件下所得到的酶解产物进行超滤，取最优分子段产物用阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱分析，得到最佳组分进行氨基酸序列分析及质谱检测。

2.2 细胞形态观察及肝细胞生化指标检测

取对数生长期的张氏肝细胞制成悬液，均匀接种至6 孔板，设低剂量组（0.1 mg/mL），高剂量组（0.4 mg/mL），模型组，正常组，培养12 h，再经600 μmol/L 的H2O2损伤4 h 后，在倒置显微镜下观察形态拍照后，测定张氏肝细胞内AST、ALT、MDA、ADH 和SOD 的含量。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

试验的分组与H2O2损伤同2.1.3 节，按照Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒说明书操作，使用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

2.4 数据处理

采用SPSS 19.0 统计软件处理数据，所有统计数据以±SD表示，组间差异采用one-way ANOVA 分析，以P＜0.05 为差异显著，有统计学意义。

3 结果

3.1 金枪鱼多肽的制备

3.1.1 张氏肝细胞损伤模型的制备 不同浓度的H2O2诱导张氏肝细胞损伤的结果见图1，从图中可以看出，为了使细胞损伤达到一定效果，又不使其过度损伤，故选择600 μmol/L 的H2O2作为损伤浓度。

3.1.2 最佳酶种的筛选 5 种蛋白酶酶解长鳍金枪鱼废弃物的结果如图2所示，胰蛋白酶酶解液对相对增值率最大，可达49.5%，因此选用胰蛋白酶进行酶解。

图1 不同浓度H2O2 对于张氏肝细胞活性的影响Fig.1 Influence of different concentrations of H2O2 on cell activity of Chang liver

图2 不同酶解液对H2O2 诱导的细胞相对增殖率影响Fig.2 The relative multiplication rate of H2O2 induced by different enzyme solution

3.1.3 酶解条件优化的正交试验设计结果 正交试验如表3所示，利用极差法分析得到不同酶解条件下影响相对增殖率的各因素主次关系为：A＞D＞B＞C＞E。故对于相对增殖率影响最大的为A（料液比）。通过比较每个水平对H2O2诱导的张氏肝细胞细胞相对增殖率的影响，本研究筛选出最佳的酶解条件为：A2B3C2D2E3，即料液比1 ∶3，酶解pH 9.0，加酶量900 U/g，酶解温度45 ℃，酶解时间5 h。在此最佳酶解条件下，经3 次重复试验验证，细胞的相对增殖率达到（63.1 ± 3.42）%。

3.1.4 酶解液超滤结果 酶解液经超滤截留试验如图4所示，TAP-1 的组分相对增殖率最高，达到88.6%。因此，选择TAP-1 的组分进行下一步纯化分离。

3.1.5 DEAE-Sepharose FF 离子交换层析分离结果 组分TAP-1 经DEAE-Sepharose FF 离子交换层析分离，从图4（a）中可知，分出4 个组分，分别是TAP-1-1，TAP-1-2，TAP-1-3 和TAP-1-4。从图4（b）中可知，TAP-1-1 组分对H2O2诱导的细胞相对增殖率最高，达到96.3%。因此，选择TAP-1-1 进行下一步纯化分离。

表3 L16（45）正交试验设计及结果Table 3 The design and results of L16（45）orthogonal experiment

图3 不同分子质量的TAP 对相对增殖率的影响Fig.3 Effects of albacore tuna polypeptides on the relative multiplication rate of different molecular weight

3.1.6 Sephadex G25 凝胶柱分离结果 组分TAP-1-1 经Sephadex G25 凝胶柱分离后，由图5（a）可知，分出3 个组分，分别为TAP-1-1-1，TAP-1-1-2 和TAP-1-1-3。由图5（b）可知，TAP-1-1-2 组分对H2O2诱导的细胞相对增殖率最高，达到68.2%。因此，选择TAP-1-1-2 组分进行下一步纯化分离。

3.1.7 反相高效液相色谱检测及多肽质谱结果TAP-1-1-2 组分经反相高效液相色谱纯化如图6（a）所示，8.177 min 出现单一峰。此峰为TAP-1-1-1 的主要物质，其对H2O2诱导的细胞相对增殖率为68.7%，具有较好的活性。其氨基酸序列为Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Ser-Lys-Cys-Phe-Lys。经质谱鉴定，从图6（b）中可看出，其分子质量为1 236.42 ku，与氨基酸测序获得的多肽的分子质量一致。

图4 阴离子DEAE-Sepharose FF 洗脱峰及阴离子分离组分对相对增殖率的影响Fig.4 Elution peaks on DEAE Sepharose Fast Flow and effects of different fractions from DEAE Sepharose Fast Flow on relative multiplication rate

图5 Sephadex G25 凝胶柱洗脱峰及Sephadex G25 凝胶柱分离组分对相对增殖率的影响Fig.5 Elution peaks on Sephadex G-25 and effects of different fractions from Sephadex G-25 on relative multiplication rate

图6 经反向高效液相色谱纯化后洗脱峰及质谱图Fig.6 RP-HPLC elution peaks and spectrum of TAP

3.2 长鳍金枪鱼多肽对H2O2 诱导的张氏肝细胞损伤的保护作用

3.2.1 肝细胞生化指标检测结果如表4所示，与正常组相比，模型组中ALT，AST，ADH 和MDA 活性显著升高，这说明张氏肝细胞经H2O2诱导，具有明显的损伤。而经长鳍金枪鱼多肽各剂量组作用之后，ALT，AST，ADH 和MDA 的活性降低，SOD的含量增加，且高剂量组均具有统计学意义。

表4 肝细胞生化指标检测结果（x±SD，n=6）Table 4 Determination results of liver cell function index （x±SD，n=6）

3.2.2 细胞形态观察结果 倒置显微镜下观察细胞形态如图7所示，图A 正常组的张氏肝细胞长势良好，细胞形态饱满，呈上皮样。经H2O2诱导4 h 后，图B 模型组中细胞形态不规则，有大片细胞漂浮；图C 低剂量组中有部分细胞形态不规则，贴壁细胞变圆，皱缩，脱落；低剂量组与高剂量组TAP 中虽有部分细胞形态不规则，但与模型组有明显区别，进一步说明TAP 对于H2O2诱导的张氏肝细胞有保护作用。

3.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡结果 流式细胞仪检测细胞凋亡的结果如图8所示，左下象限显示正常细胞，显示为（FITC-/PI-）；右下象限为早期凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）；右上象限为凋亡晚期或是死细胞，为（FITC+/PI+）。与正常组相比，其它各组晚期凋亡细胞明显增多，正常细胞明显减少。与模型组相比，低剂量组与高剂量组晚期凋亡细胞减少，其中高剂量组晚期凋亡细胞减少明显。

图7 倒置显微镜下的张氏肝细胞（×200）Fig.7 Morphological changes of Chang liver cells under an inverted microscope （×200）

图8 流式细胞仪检测TAP 对H2O2 诱导的张氏肝细胞的影响Fig.8 The effect of TAP on Chang liver cells induced by H2O2 was detected by flow cytometry

4 讨论与结论

肝脏作为人体内最大的解毒器官，对来自体内外的有毒物质通过一定的生物转化方式将其分解或以原形排出体外。在这个过程中，肝脏容易受到损害，引起肝脏的炎症、肿大、坏死、纤维化甚至导致肝硬化，从而失去治愈的机会。我国是肝病大国，每年因肝病死亡人数达到35 万人以上。因此，对于肝病的防护成为人们不可忽视的话题[6]。尽管治疗肝病的药物众多，但这些化学合成药物的长期应用加重肝代谢的负担，甚至引起原有肝病的恶化。海洋作为生命的起源地，蕴藏着大量的天然药物，从海洋生物中提取高效、低毒的保肝活性物质成为当今研究的热点[7]。而海洋生物活性多肽更显示出明显的优势而倍受关注。海洋生物活性多肽的提取方法有直接提取法、酶水解法和化学合成法等。其中酶水解法具有反应条件温和、设备要求低、易操作、转化率高等优点[8]。因此本试验利用长鳍金枪鱼加工过程的废弃物，运用酶解提取分离技术获得活性多肽，以H2O2诱导张氏肝细胞的相对增殖率为指标，在5 种常见酶中选出胰蛋白酶为本试验用酶，单正交试验优化酶解条件，再经纯化分离，得到长鳍金枪鱼多肽的关键技术为：料液比1∶3，pH 9，加酶量900 U/g，温度45 ℃，时间5 h，其N 端氨基酸序列为Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Ser-Lys-Cys-Phe-Lys。这对于开发海洋护肝功能食品具有较好的应用前景。

肝细胞是肝脏中最主要的细胞，肝细胞损伤是肝病的共同病理基础，是不同肝病的共同表现[9]。因此建立肝细胞损伤模型对于研究肝病的发生、防治可避免动物模型的周期较长、试验条件易变等不利因素而被广大学者所采用，张氏肝细胞是肝细胞损伤的首选细胞。而H2O2作为诱导源具有易溶于水、价格便宜、损伤能力强、性质相对稳定的特点，是建立细胞氧化损伤的理想诱导剂[10]。试验发现600 μmol/L 的H2O2损伤4 h 后可引起张氏肝细胞的损伤，这与黄丽等[11]研究的肝细胞损伤模型相似。因此，通过肝细胞生化指标的检测，可反映肝细胞功能的变化。当肝细胞受到一定程度的损伤时，细胞膜通透性增加，ALT、AST 从线粒体和胞浆中释出。ALT、AST 活性越高，说明细胞受损越严重[12]。MDA 与SOD 的含量可以反映肝细胞对于氧自由基的清除能力与肝细胞受自由基损伤的严重程度[13]。ADH 活性的增高能间接说明ALT 活性的增高只是由于肝细胞受损而引起的。试验结果表明，肝细胞的损伤程度减轻，TAP 对于酶活性的维持起到了保护作用。

倒置显微镜下观察肝细胞的形态学变化能较直接地反映其结构的改变，试验表明，经H2O2诱导的张氏肝细胞损伤明显，大片细胞悬浮；而经TAP 作用后，细胞形态较模型组有较大改善。当细胞受到损伤后除形态学改变外，还会引进细胞膜内表面上的磷脂酰丝氨酸外翻而表现出凋亡，细胞凋亡是机体生长发育和病理状态中细胞死亡的过程[14]。借助于外翻的磷脂酰丝氨酸能与Annexin V 高度亲和结合的原理，通过流式细胞仪能进行检测。将Annexin V 标以荧光素FITC，再结合核酸染料PI，就能把正常细胞，处于不同凋亡时期的细胞和坏死细胞加以区分开来。本试验利用Annexin V FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒，经流式细胞仪检测后显示，与模型组相比，低剂量组晚期细胞平均凋亡率减少6.6%，高剂量组晚期细胞平均凋亡率减少18.7%，进一步说明TAP 对于细胞凋亡具有一定的抑制作用。

综上，在高剂量（0.4 mg/mL）的TAP 作用下，经H2O2诱导的张氏肝细胞受到了较好的保护作用。但TAP 如何保护经H2O2诱导的张氏肝细胞的相关机制还需进一步研究。