不同产地黄连抗内毒素活性的研究

陈玉兰 沈宏萍 邵盛春 蒲清荣 张艺（通讯作者）

（1 西南医科大学附属中医医院 四川 泸州 646000）

（2 成都中医药大学 四川 成都 610075）

中药药理成分经现代医学研究发现，认为中药方剂中具有清热解毒效果的药物，通常在治疗中可起到抗细菌内毒素、解热、抗炎、抗病原微生物以及增强免疫能力效果[1-3]，中医理论视角下，内毒素被归纳为“毒邪”，隶属于“清热”治疗范畴，黄连为解毒泻火、燥湿清热药物，为探究其品质，本文通过测定不同产地黄连体外内毒素活性水平，将黄连清热解毒功能依据产地划分，将其内在生物学价值及功效差异以采取动态比浊法评价。

1.实验材料

1.1 仪器与材料

试剂：取规格为5ml/支、批号为180908、厂商为湛江安度斯生物有限公司的检查用水；取规格为0.1EU/ml、批号为1805050、厂商为湛江安度斯生物有限公司的鲎试剂；取规格为10EU/支、批号为080725、厂家为中国生物制品检验所的内毒素标准品；取批号为20130011、厂商为上海三浦化工有限公司羧甲基纤维素钠（羧甲基纤维素钠）。

仪器：取型号为WH-2型、厂商为上海沪西分析仪器厂的微型旋涡混合仪；取型号为DSY-1-4孔、厂商为北京国华医疗器械厂的恒温水浴锅；取型号为S·SW-CJ-1F型、厂商为上海跃进医疗器械厂的净化工作台；取型号为LDZX-40BI型、厂商为上海申安医疗器械厂的压力蒸汽灭菌器；取型号为BET-32M型、厂商为天津大学无线电厂的细菌内毒素分析仪；取型号为101C-2型、厂商为上海实验仪器厂有限公司的电热鼓风干燥箱。

1.2 实验样品

黄连样品10批购至泸州宝光医药有限公司，产地分别为四川峨眉、洪雅、彭州、大邑、重庆石柱、湖北利川，鉴定中药师为蒲清荣主任（西南医科大学附属中医医院制剂室），均符合2015年版《中国药典》黄连项下规定。

2.实验方法

2.1 黄连样品的制备

各取1.6g不同产地黄连粉，两次超声提取，每次溶剂选100mL甲醇，过滤、取渣、挥干、收集。取0.5%羧甲基纤维素钠溶液溶解残渣，定容至10mL，获取与近似于原生药材浓度（160mg/mL）黄连原液，后向安瓿瓶转移。以8次梯度稀释，稀释浓度分别为 1/21、1/22、1/23、1/24、1/25、1/26、1/27、1/28。另取2mL 5%羧甲基纤维素钠混悬液，分别加至2个安瓿瓶，作为对照管（阳性及阴性），见表。

表 黄连样品编号及产地

2.2 高压灭菌

对0.5%羧甲基纤维素钠混悬液、黄连原液安瓿瓶行高压蒸汽灭菌，设置温度、压力及灭菌时间（分别为121℃、0.1MPa、0.5h），随用随取。

2.3 测试样品抗内毒素活性

2.3.1 制备内毒素标准溶液 取内毒素标准品（10 EU），于15ml检查用水中稀释，经1/4h充分涡旋混合后，获得浓度为2 EU/ml，置于灭菌的锥形瓶中。

2.3.2 药物与内毒素反应 取玻璃试管，先后加入0.2ml内毒素标准溶液和药物溶液，封口膜封闭后，持续2min涡旋混合，后恒温（37℃）水浴孵育1h。

2.3.3 反应及测定 取定量专用试管，先后加入孵育后液体、鲎试剂，均为0.1ml，封口膜封闭后，净化工作台上混匀后测定。

2.4 黄连样品制备方法考察

准确称取两份1.6g黄连粉末（HL-001），分别置锥形瓶、圆底烧瓶中，用100mL甲醇超声提取2次；以160ml蒸馏水回流，去上清，合并残渣、挥干。在羧甲基纤维素钠中溶解残渣，定容至10mL后向安瓿瓶转移，备用[4]。

2.4.1 黄连样品抗内毒素测定 原液以1/21、1/22、1/23、1/24、1/25获取药物浓度（mg/ml）分别为80×20、80×2-1、80×2-2、80×2-3、80×2-4。另取两个试管作为对照管（阴性及阳性），均加0.2mL0.5% 羧甲基纤维素钠混悬液。

2.4.2 实验结果 与模型对照管比较中，超声液21、22、23、24、25倍稀释与水煎液21、22、23倍稀释的反应时间明显延长（P＜0.01），说明超声液稀释21、22、23、24、25倍，水煎液稀释21、22、23倍内毒素活性明显。

3.实验结果

在不同产地的黄连甲醇超声提取物进行稀释，稀释至1/256，并进行体外抗内毒素活性研究，数据用SPSS 11.5处理，以单因素方差分析进行组间差异比较，方差齐，则以LSD检验，方差不齐则以Tamhane's T2检验，差异存在统计学意义则P＜0.05。结果显示13-18号黄连样品（产地为峨眉、洪雅）在体外最低抗内毒素浓度（0.625mg/ml）时均具有明显的体外抗内毒素活性，而其它产地的黄连样品在该稀释度下有些已无抗内毒素活性。

4.讨论

结果表明，不同产地黄连体外抗内毒素活性不同，13-18号黄连样品（产地为峨眉、洪雅）在体外最低抗内毒素浓度（0.625mg/mL）时均具有明显的体外抗内毒素活性，而其它产地的黄连样品在该稀释度下有些已无抗内毒素活性。结果表明，峨眉、洪雅产地的黄连样品体外抗内毒素活性强于其它产地，这与《本草纲目》中记载，虽在蜀皆有黄连，但以眉州、雅州品质最佳相符。