骨保护素/脱蛋白骨复合物对兔前交叉韧带重建后腱-骨愈合的影响

粟玉斌 蒋尧传 胡军组 王洪凯 孙岩

前交叉韧带(Anterior cruciate ligament，ACL)是膝关节重要稳定结构，损伤后不易自我恢复，可导致关节软骨面和半月板的损伤。ACL重建术是目前主要的治疗方法，能有效恢复膝关节运动功能。目前常采用自体腘绳肌肌腱作为移植物，故肌腱与骨隧道的愈合，成为影响术后疗效的关键。骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)在骨代谢过程中有着极其重要的生物学作用[1]，可用于ACL重建以提高手术疗效。因有“滑液灌注效应”等的影响，所以单纯应用OPG易造成流失[2]。脱蛋白骨(Deproteinized bone，DPB)是一种临床上应用广泛的载体材料[3]，具有良好的缓释功能。本实验将OPG复合于DPB后植入ACL重建动物模型中，观察其对腱-骨早期愈合的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康新西兰大白兔60只，雌雄不限，体质量(2.6±0.5)Kg，随机分为 4 组(n=15)：即OPG组、DPB组、OPG/DPB组及对照组，均建立ACL重建模型，腱-骨界面分别植入OPG、DPB及OPG/DPB，对照组旷置处理。

1.2 OPG/DPB复合物的制作

根据文献[4]的方法制备DPG，然后将DPB与OPG水溶液混合后4 ℃真空条件下放置4～6 h，让OPG充分吸附于DPB，即制作成OPG/DPB复合物，存于4 ℃冰箱备用。

1.3 手术方法及处理

4组动物术前禁水、食8 h，耳缘静脉注射戊巴比妥钠(2 mL/Kg)，左膝关节及左侧跟腱部位备皮。ACL重建方法参照邹国耀等[5]的报道。OPG组将100 μg OPG(每只动物)溶于水后分别于胫骨及股骨隧道内注射，使其充分渗入松质骨内；DPB组采用克氏针将1 g DPB(每只动物)挤送入骨隧道内，向隧道内壁各个部位涂抹；OPG/DPB组每只动物同法植入100 μg OPG+1 g DPB复合物；对照组除ACL重建外不予任何处理。逐层缝合关闭切口，纱布包扎固定。术后前3天肌注青霉素(10万U/只)抗感染，每天观察伤口及一般情况，术后7 d拆线。

1.3 观察指标

1.3.1一般情况

观察术后存活、精神及活动、切口愈合等情况。

1.3.2解剖学大体观察

观察韧带的外观形态、张力情况及隧道口闭合情况。

1.3.3生物力学检测

每组于术后4、8、12周随机处死5只动物，截取完整膝关节。将股骨和胫骨残端分别固定于INSTRON-4411 型生物力学测试仪上进行牵拉试验(5.0 mm/s)，直到肌腱从骨隧道中拉出，记下脱出时的加载负荷。

1.3.4组织学观察

术后4、8、12周取材后，石蜡包埋切片。HE染色观察腱-骨界面各种组织细胞的分布情况。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况

所有实验动物均存活至实验完成，术后精神及活动可，手术切口均愈合良好。

2.2 解剖学大体观察

各组膝关节移植肌腱连续性好，与隧道壁连接完整。术后4周时，均填充以瘢痕组织。术后8周时，各组填充主要为软骨组织，骨化最明显是OPG/DPB组。术后12周时，以骨样组织封闭的是OPG组、OPG/DPB组，DPB组和对照组骨化不明显。

2.3 生物力学测试

术后4周时，最大加载负荷各组差异无统计学意义(P>0.05)。术后8周时，最大加载负荷OPG/DPB组高于OPG组(P<0.05)，OPG组高于DPB组(P<0.05)和对照组(P<0.05)，DPB组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)；术后12周，各组间差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 不同时间点各组生物力学检测结果比较

2.4 组织学观察

术后4周，OPG组腱-骨界面有少量含血管的纤维结缔组织，排列疏松；DPB组的腱-骨结合不够紧密，散在分布有新生骨细胞；OPG/DPB组腱-骨界面结合紧密，有较多含有血管的纤维结缔组织；对照组腱-骨界面排列疏松，结合不紧密(图1)。

术后8周，OPG组腱-骨界面可见Sharpey样纤维，走行不规则，少许向肌腱内长入；DPB组腱-骨偶有Sharpey样纤维，结合疏松，排列无序；OPG/DPB组有零星的钙化软骨和骨组织，纤维排列较有序，较多新生骨组织长入肌腱；对照组少见Sharpey样纤维，腱骨结合疏松(图2)。

a：OPG组；b：DPB组；c：OPG/DPB组；d：对照组A:OPG group; B:DPB group; C:OPG / DPB group; D:Control group

a：OPG组；b：DPB组；c：OPG/DPB组；d：对照组A:OPG group; B:DPB group; C:OPG / DPB group; D:Control group

术后12周，OPG组可见大量Sharpey样纤维，有较多骨性组织长入，局部可见钙化的纤维软骨；DPB组有少量新骨形成，肌腱与骨组织形成纤维软骨连接；OPG/DPB组可见典型的4层结构，但部分新生骨组织未成熟；对照组纤维软骨明显，但比OPG组差(图3)。

a：OPG组；b：DPB组；c：OPG/DPB组；d：对照组A:OPG group; B:DPB group; C:OPG / DPB group; D:Control group

3 讨论

ACL重建的关键是腱-骨愈合。腱-骨愈合是指在移植肌腱和骨之间的愈合，最终达到肌腱和骨之间结构一体和功能连续的形式[6]。前交叉韧带从韧带向止点方向分别为韧带、纤维软骨、钙化软骨和骨[7]。而腱-骨愈合分为直接愈合和间接愈合[8]。韧带重建后，腱-骨界面以间接愈合为主，由Sharpey样纤维直接长入骨组织以获得固定效果，在纤维软骨与钙化纤维软骨之间由“潮线”相隔。

组织学观察显示，术后4周时，各组均未见Sharpey样胶原纤维，由纤维结缔组织填充；术后8周时，OPG/DPB组Sharpey样胶原纤维最为明显；术后12周时，OPG/DPB组可见典型4层结构，表明OPG/DPB复合物对形成直接止点有促进作用。

术后24～32周重建的 ACL 的腱之间骨连接达到正常 ACL 的止点结构。生物力学测试显示，术后4周各组最大加载负荷差异无统计学意义；术后8周，OPG/DPB组最大加载负荷最高，有统计学意义；术后12周，各组差异无统计学意义。说明OPG/DPB复合物能有效增加腱-骨愈合能力。

促进腱-骨愈合的方法众多，有细胞生长因子、骨形态发生蛋白、骨膜等。OPG主要是通过抑制破骨细胞的发生并促进其凋亡。安明等[9]证实，OPG对交叉韧带重建后腱-骨愈合有促进作用，但由于“滑液灌注效应”的影响，OPG易流失，故会影响早期肌腱和骨道壁之间纤维结缔组织的形成。倪锋等[10]的重建动物模型中，将腱-骨隧道填充磷酸钙，避免了骨隧道内的渗血稀释作用，从而保证了成分的存留，显著促进了腱-骨愈合过程。翟文亮等[11]将血小板血浆复合于DPB，该复合物也可显著促进腱-骨愈合。本实验将OPG与DPB制成复合物，结果亦显著促进ACL重建术后的腱-骨愈合。

综上所述，本研究证实了OPG/DPB复合物可显著促进了ACL重建术后的腱-骨早期愈合，为今后的临床应用提供了的理论基础。