膝骨性关节炎者TLR-4、IL-1β的表达变化及临床意义

毛洪刚 朱艳丽 刘岩 刘国栋 张飞

[摘要] 目的 探討膝骨性关节炎（KOA）患者血清、膝关节液中Toll样受体-4（TLR-4）、白细胞介素-1β（IL-1β）的表达变化及临床意义。 方法 选择2017年6月～2018年12月内蒙古医科大学第三附属医院（以下简称“我院”）骨科门诊收治的KOA患者220例作为观察组，根据KOA的严重程度，将其分为轻度亚组（n = 98）、中度亚组（n = 80）和重度亚组（n = 42），另外选取我院健康中心体检志愿者60名作为对照组。酶联免疫吸附试验检测血清和关节液中TLR-4和IL-1β水平，分析TLR-4和IL-1β水平与KOA严重程度及两者之间的相关性。 结果 观察组血清及关节液中TLR-4和IL-1β水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。重度亚组血清及关节液中TLR-4和IL-1β水平高于轻度亚组和中度亚组，中度亚组血清及关节液TLR-4和IL-1β水平高于轻度亚组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。血清和关节液TLR-4和IL-1β水平与KOA的严重程度呈正相关（r = 0.706、0.729、0.741、0.715，均P < 0.05）;血清TLR-4水平与IL-1β水平呈正相关（r = 0.720，P < 0.05）;关节液TLR-4水平与IL-1β水平呈正相关（r = 0.736，P < 0.05）。 结论 KOA患者血清和关节液中TLR-4和IL-1β水平异常升高，且与KOA的严重程度联系密切，可以用于临床上KOA的预测、诊断及治疗。

[关键词] 膝骨性关节炎;血清;膝关节液;Toll样受体-4;白细胞介素-1β;相关性

[中图分类号] R684.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）01（c）-0082-04

Expression changes and clinical significance of TLR-4 and IL-1β in serum and knee joint fluid of patients with knee osteoarthritis

MAO Honggang1   ZHU Yanli2   LIU Yan1   LIU Guodong1   ZHANG Fei1

1.Department of Orthopedics， the Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University （Inner Mongolia Baogang Hospital）， Inner Mongolia Autonomous Region， Baotou   014010， China; 2.Department of Anesthesiology， the Second Affiliated Hospital of Baotou Medical College， Inner Mongolia University of Science and Technology， Inner Mongolia Autonomous Region， Baotou   014030， China

[Abstract] Objective To investigate the expression changes and clinical significance of Toll-like receptor-4 （TLR-4） and interleukin-1β （IL-1β） in serum and knee joint fluid of patients with knee osteoarthritis （KOA）. Methods From June 2017 to December 2018， 220 cases with KOA who admitted in Department of Orthopedics， the Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University （“our hospital” for short） were selected as observation group. According to the severity of KOA， they were divided into mild subgroup （n = 98）， moderate subgroup （n = 80） and severe subgroup （n = 42）. In addition， 60 cases of volunteers were selected for physical examination in our hospital of health center medical as control group. The levels of TLR-4 and IL-1β in serum and knee joint fluid were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. The correlation between TLR-4， IL-1β levels and KOA severity were analyzed and their correlation were analyzed. Results The levels of TLR-4 and IL-1β in serum and knee joint fluid of observation group were significantly higher than those of control group， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. The levels of TLR-4 and IL-1β in severe subgroup were significantly increased than those of moderate subgroup and mild subgroup， compared with mild subgroup， the levels of TLR-4 and IL-1β in moderate subgroup were significantly increased， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Serum and knee joint fluid TLR-4 and IL-1β levels were positively correlated with KOA severity （r = 0.706， 0.729， 0.741， 0.715， all P < 0.05）. Serum TLR-4 level was positively correlated with IL-1β level （r = 0.720， P < 0.05）. The level of TLR-4 in knee joint fluid was positively correlated with IL-1 level （r = 0.736， P < 0.05）. Conclusion The levels of TLR-4 and IL-1β in serum and knee joint fluid of KOA patients unusually increase， which is closely related with the severity of KOA. It can be used for clinical prediction， diagnosis and treatment of KOA.

[Key words] Knee osteoarthritis; Serum; Knee joint fluid; Toll-like receptor-4; Interleukin-1β; Correlation

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）的实质是关节软骨退行性变化，关节活动受限，严重影响生活质量，且该病多发生于中老年人群。而膝骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）占OA所有类型的78.5%[1-2]。KOA是临床常见的慢性炎症性疾病之一，临床主要特征为关节软骨退行性变化、骨质增生，同时伴随骨滑膜炎症。另外，KOA患者的膝关节可出现疼痛、关节畸形等[3-5]。随着我国人口老龄化速度的加快，KOA已经成为导致中老年人群致残的重要因素，但其诊断缺乏有效的生化指标，若不能对早期KOA进行诊断，则会丧失有效的治疗时机[6]。

KOA的发病机制尚未明确，同时缺乏有效的治疗药物，因此寻找其致病机制，并进行有效的治疗成为研究重点。人们一直认为KOA的发生与多种细胞因子的关系密切，如白细胞介素（IL）家族，从分子水平揭示组织细胞的变化机制。近年来，随着生物分子学技术的发展，逐渐发现Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）家族對于非特异性免疫的调节功能具有重要作用，同时也可以将特异性免疫和非特异性免疫连接起来[7]。TLR-4和IL-1β胞浆区同源性较高，并且两者与KOA的关系紧密，两者可能共同参与KOA的病变过程[8-9]。这为临床上探索KOA的具体致病机制提供思路。本研究通过检测血清及膝关节液中TLR-4和IL-1β水平及其相关性，为寻找KOA致病机制和治疗途径提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年6月～2018年12月内蒙古医科大学第三附属医院（以下简称“我院”）骨科收治的KOA患者220例，作为观察组，其中男104例，女116例;年龄50～75岁，平均（62.26±5.15）岁;体重指数19.25～23.12 kg/m2，平均（21.25±1.36）kg/m2;病程2～6年，平均（3.76±1.02）年。根据KOA的严重程度[10]，将其分为轻度亚组98例，中度亚组80例，重度亚组42名。另外选择于我院健康中心体检的志愿者60例，作为对照组，其中男26名，女34名;年龄48～77岁，平均（61.35±4.26）岁;体重指数19.10～22.89 kg/m2，平均（21.07±1.17）kg/m2。两组基本资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准。

纳入标准：①符合KOA诊断标准[11];②患者的临床资料完整，且依从性高;③患者及其家属同意，并签署知情同意书。排除标准：①伴有高血压、冠心病等其他慢性疾病;②患者有膝关节手术史及感染史;③伴有类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等免疫性疾病;④入组前半个月使用糖皮质激素等药物。

1.2 疾病诊断标准

所有患者均符合中华医学会骨科分会2007版OA诊疗中关于KOA的标准[11]：①1个月内膝关节疼痛现象反复出现;②膝关节X线扫描结果显示关节腔变窄，有关节缘骨赘形成;③关节液清亮且黏稠，白细胞数量<2×106个/L;④年龄>40岁，膝关节僵硬时间<30 min，且活动时出现骨摩擦音。患者符合①和②，①、③和④，①～④均可诊断为KOA。

应用关节镜对软骨损伤程度进行评级[10]：①Ⅰ度，关节表面出现定都肿胀;②Ⅱ度，关节表面有直径<1 cm的毛糙和浅表溃疡、纤维化;③Ⅲ度，关节表面有直径>1 cm的深度溃疡，但软骨下骨并未暴露;④Ⅳ度，软骨下骨暴露。

使用X线对软骨损伤进行诊断[6]：①Ⅰ级，关节腔无变化，出现微小骨赘;②Ⅱ级，关节腔轻度变窄，且出现轻度骨赘;③Ⅲ级，关节腔显著变窄，出现中度骨赘;④Ⅳ级，关节腔显著变窄，并出现大量的重度骨赘。

1.3 KOA分级标准

轻度亚组：软骨损伤为Ⅰ度且Kellgren-Lawrence（K-L）分级为0～Ⅰ级;中度亚组：软骨损伤为Ⅱ～Ⅲ度和/或K-L分级为Ⅱ级;重度亚组：软骨损伤为Ⅳ度和/或K-L分级为Ⅲ～Ⅳ级。

1.4 方法

受试者均抽取空腹外肘静脉血3 mL，静置20 min后，3500 r/min离心10 min，离心半径为4 cm，取上清液，置于-80℃冰箱中待测。受试者取坐位，局部麻醉后，抽取关节液2 mL，置Eppendorf管中，-80℃冰箱中待测。酶联免疫吸附试验检测血清和关节液中TLR-4（批号：170427）和IL-1β（批号：170316）水平，试剂盒由美国R&D公司生产，严格按照试剂盒上的说明进行操作。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，血清及关节液中TLR-4和IL-1β水平用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，两组间比较采用t检验;血清及关节液中TLR-4和IL-1β水平与KOA严重程度及两者之间的相关性采用Pearson或Spearman相关性分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清及关节液中TLR-4和IL-1β水平比较

观察组血清及关节液中TLR-4和IL-1β水平均高与对照组，差异有统计学意义（均P < 0.05）。见表1。

2.2 不同程度KOA亚组血清及关节液中TLR-4和IL-1β水平比较

重度亚组血清及关节液中TLR-4和IL-1β水平高于轻度亚组和中度亚组，中度亚组血清及关节液中TLR-4和IL-1β水平高于轻度亚组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表2。

2.3 Spearman相关性结果

血清和关节液TLR-4和IL-1β水平与KOA严重程度呈正相关（r = 0.706、0.729、0.741、0.715，均P < 0.05）。

2.4 Pearson相关性结果

血清TLR-4水平与IL-1β水平呈正相关（r = 0.720，P < 0.05）;关节液TLR-4水平与IL-1β水平呈正相关（r = 0.736，P < 0.05）。

3 讨论

目前对于KOA的治疗缺少有效的治疗方法，KOA患者的组织细胞受到多种损伤因素的刺激，致使组织细胞发生变性，甚至坏死;而机体则会产生一系列的应激反应，减轻损伤程度[1]。有研究报道显示[12]，导致KOA的原因有外伤、年龄、免疫功能异常、负重过度及家族遗传等，但具体机制需进一步研究。有研究显示[8]，炎性反应和免疫应激反应对于KOA的发生及发展具有重要意义。KOA不仅是累及全身关节的炎症性疾病，而且自身免疫反应在KOA的发展过程中发挥重要作用[13]。

1985年，Toll样受体由Nusslein Volhard在果蝇的胚胎中发现，该受体属于一类跨膜蛋白受体，能够识别脂多糖、细菌脂蛋白等外源性配体[7-9]。TLR-4作为Toll家族中重要的成员之一，是一种Ⅰ型跨膜蛋白受体，主要由细胞内外区和跨膜区组成，能够通过特异性启动自身免疫反应参与多种疾病的发展[14]。TLR-4位于9q32-33，包括879个氨基酸，细胞外由富含亮氨酸的序列组成[15]。TLR-4与炎性反应中IL-1β同源性高。IL-1β是IL-1家族的重要成员之一，在KOA患者的软骨组织中呈强阳性表达，动物实验和细胞试验也发现IL-1β对于KOA具有重要作用[7]。

本研究发现，观察组血清及关节液中TLR-4和IL-1β水平高于对照组（P < 0.05），同时随着KOA严重程度的加重，患者血清及关节液中TLR-4和IL-1β水平均显著升高（P < 0.05），另外Spearman相关性显示，血清和关节液中TLR-4和IL-1β水平与KOA的严重程度呈正相关（P < 0.05），提示TLR-4和IL-1β参与KOA发生发展，这与王学宗等[7]的研究结果一致。出现这种现象的原因为TLR-4的信号转导通路能够激活软骨分解酶类及炎性因子的释放，如金属基质蛋白、肿瘤坏死因子及IL-1等，导致KOA患者的软骨代谢平衡异常[16-17]。IL-1β参与KOA的过程可能与以下个方面相关：①与金属基质蛋白的合成有关，金属基质蛋白能够降解细胞外基质的蛋白成分，造成KOA[18];②提高肿瘤坏死因子和血管内皮细胞黏附因子的表达水平、强化一氧化氮等炎性介质的作用[19];③减少蛋白多糖的合成量，增加糖酵解量，导致软骨组织基质降解，加速软骨细胞的凋亡，共同参与KOA的发病过程[20];④增强B细胞的生长速度，抑制软骨细胞胶原蛋白的表达，发挥骨吸收功能[21];⑤加速滑膜组织和软骨组织中前列腺素E2的释放，而前列腺素E2又可提高IL-1β对软骨的分解作用[22];⑥提高胶原酶的促炎作用[8]。

Pearson相关性分析显示，血清TLR-4水平与IL-1β水平呈相关（P < 0.05）;关节液TLR-4水平与IL-1β水平呈正相关（P < 0.05）。提示TLR-4和IL-1β之间存在密切的相关性，可能是由于两者存在较高的同源性，主要通过TLR/4Myd88/NF-κB信号通路激活核因子，诱发机体的全身免疫性反应，共同参与KOA的发展过程[8]。

综上所述，KOA患者血清及关节液中TLR-4和IL-1β水平异常升高，与疾病的发展密切相关，临床上不仅可以用于预测疾病的发生，还可用于监测KOA的发展程度。另外，其可作为临床治疗KOA的靶点，值得在临床上推广应用。

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（收稿日期：2019-08-23  本文编辑：刘明玉）

[基金项目] 中国金属学会冶金安全与健康分会健康卫生科研项目（jkws201835）。

[作者简介] 毛洪刚（1980.3-），男，硕士;研究方向：骨与关节外科。

[通讯作者] 朱艳丽（1980.4-），女，硕士，副主任医师;研究方向：麻醉医学。