Regesi再生硅、Bio-Oss骨粉对成骨细胞增殖、 成骨分化作用的影响

贾琰 张保荣

Regesi再生硅、Bio-Oss骨粉對成骨细胞增殖、

成骨分化作用的影响

贾   琰1      张保荣2

1.潍坊医学院口腔医学院，山东潍坊   261053;2.航空总医院口腔诊疗中心，北京   100012

[摘要] 目的 观察小鼠成骨细胞（MC3T3-E1）分别在Regesi再生硅和Bio-Oss骨粉材料上的生长情况，分析Regesi再生硅材料、Bio-Oss骨粉对小鼠成骨细胞增殖、成骨分化的影响。 方法 将实验分为3组，分别为Regesi再生硅实验组、Bio-Oss骨粉实验组和对照组，将两种材料分别放置于24孔板中，对照组为空白，将细胞分别接种在各组24孔板上，培养1、4、7 d时倒置显微镜观察细胞生长情况;培养1、4、7 d时MTT检测细胞的增殖活性;培养7 d时碱性磷酸酶（ALP）试剂盒测定成骨细胞的OD值来分析ALP活性;培养7 d时Rt-PCR方法测定3组细胞的Runx2和Osterix（OSX）基因表达情况。 结果 显微镜下观察，各组细胞随着时间增加而数量增加;培养7 d时与对照组比较，Regesi再生硅组细胞增殖水平升高（P < 0.05），ALP活性、Runx2、OSX mRNA表达水平升高（P < 0.05），培养7 d时Bio-Oss骨粉组细胞增殖水平降低（P < 0.05），ALP活性、Runx2、OSX mRNA的表达差异无统计学意义（P > 0.05）。结论 Regesi再生硅能促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化水平;Bio-Oss骨粉能减缓细胞增殖，但成骨分化能力与单纯成骨细胞无明显差异。

[关键词] 增殖;成骨分化;Regesi再生硅;Bio-Oss骨粉;MC3T3-E1细胞

[中图分类号] R318          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）01（c）-0013-04

Effect of Regesi regeneration silicon and Bio-Oss bone meal on proliferation and osteogenic differentiation of osteoblasts

JIA Yan1   ZHANG Baorong2

1.Oral Medicine School， Weifang Medical College， Shandong Province， Weifang   261053， China;2.Oral Clinic， Aviation General Hospital， Beijing   100012， China

[Abstract] Objective To observe the growth of mouse osteoblast （MC3T3-E1） on Regesi regeneration silicon and Bio-Oss bone powder， and to analyze the effects of Regesi regeneration silicon materials and Bio-Oss bone powder on mouse osteoblast proliferation and osteogenic differentiation. Methods The experiment was divided into three groups， respectively Regesi regeneration silicon group， Bio-Oss bone powder group and control group. The two materials were placed in 24-well plates， while the control group was blank. Cells were inoculated on 24-well plates in each group， and the cell growth was observed by inverted microscope at 1， 4 days， and 7 days of culture; MTT was used to detect cell proliferation activity at 1， 4 days， and 7 days of culture; OD value of osteoblasts was determined by alkaline phosphatase （ALP） kit at 7 d culture to analyze ALP activity. Rt-PCR method was used to determine Runx2 and Osterix（OSX） gene expression in 3 groups of cells at 7 days of culture. Results Under the microscope， the number of cells in each group increased with time. The proliferation level of cells in Regesi group increased （P < 0.05）， and the ALP activity elevated，the expression levels of Runx2 and OSX mRNA increased at 7 days of culture（P < 0.05）. The proliferation level of cells in the bio-Oss bone meal group was decreased at 7 days of culture（P < 0.05）， and there was no significant difference in the ALP activity， and the expression levels of Runx2 and OSX mRNA （P > 0.05）. Conclusion Regesi regenerated silicon can promote the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells. Bio-Oss bone powder can decrease cell proliferation， while there is no significant difference between osteogenic differentiation ability and osteoblasts alone.

[Key words] Proliferation; Osteogenesis differentiation; Regesi regeneration silicon; Bio-Oss bone meal; MC3T3-E1 cells

口腔颌面部骨组织结构是支撑面型的重要基础，因各种原因造成的骨组织缺损[1]，极大地影响了患者的健康和生活。如何更好地修复骨缺损，是临床醫生亟待解决的问题和难题。硅已被证实能够增加各种材料的生物活性，且不影响他们的机械性能或诱导细胞毒性[2]，本研究通过试验一种新材料-Regesi再生硅对小鼠成骨细胞增殖、成骨分化作用的影响，分析Regesi再生硅的生物学性能。

1 材料与方法

1.1 实验材料与设备

MC3T3-E1细胞株;Regesi再生硅（幸福益生公司，中国，批号：2019041605）;Bio-Oss骨粉[盖思特利商贸（北京）有限公司，批号：81700762];四甲基偶氮唑蓝（MTT）;碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（南京建成，中国，批号：201907 13）;倒置显微镜（奥林巴斯IX51，日本）;酶标仪（德国）;RNA提取试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司，批号：AJ31039A];One Step TB Green？誖PrimeScriptTM Rt-PCR Kit（Perfect Real Time）[宝生物工程（大连）有限公司，批号：AJ11126A];PCR引物（北京天一辉远生物科技有限公司）;荧光定量PCR仪（ABI7500，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养  将MC3T3-E1细胞株培养于α-MEM培养基（含1%双抗混合液、10%FBS）中，细胞培养箱内5%CO2、37℃常规培养，3～4 d传代1次，待细胞进入对数生长期后进行实验。

1.2.2 实验分组  将实验分为3组：Regesi再生硅实验组、Bio-Oss骨粉实验组、对照组。将各组材料灭菌后固定于24孔细胞培养板中，每孔约0.2 g，将成骨细胞接种到预湿后的材料上，放于培养箱中培养，隔天换液。

1.2.3 倒置显微镜观察各组材料的细胞生长情况  在细胞复合培养至第1、4、7天，在倒置显微镜下分别观察3组细胞生长情况。

1.2.4 MTT试验检测细胞增殖情况  在细胞与材料接种培养至第1、4、7天时进行MTT实验，取3组细胞各8孔，每孔加入配制5 mg/mL MTT溶液100 μL，继续放入培养箱4 h后取出培养板，吸弃孔中培养液，再每孔加入DMSO 750 μL后移入96孔板中。置于37℃摇床震荡15 min以充分溶解结晶物。然后从每孔吸取200 μL放入酶标仪中在490 nm单波长处测定各孔吸光度值（OD值）。

1.2.5 碱性磷酸酶测定盒测定ALP活性  当细胞在材料上培养至第7天，取3组细胞各8孔，吸弃培养孔中培养液，PBS缓冲液冲洗3遍后每孔加入1%TritonX-100细胞裂解液100 μL冰上裂解30～40 min。再按照ALP活性测定试剂盒操作说明书测定在520 nm波长处的吸光度值。

1.2.6 Rt-PCR测定3组中Runx2和OSX基因表达情况  当细胞在材料上培养至第4天时，加入矿化诱导液（含50 μg/mL维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠和10%FBS的α-MEM培养基），再培养7 d后，采用RT-PCR技术测定Runx2（Runt related transcription factor 2）和Osterix（OSX）基因表达量。反转录引物名称及序列如下。OSX上游引物序列：5′-GCTCGTCTGACTGCCTGCCTAGTGT-3′，下游引物序列5′-ACC-TGGTGAGATGCCTGCGTGGAT-3′;Runx2上游引物序列：5′-CCTTCCAGACCAGCAGCACTCCAT-3′，下游引物序列5′-TCCGTCAGCGTCAACACCATCATTCT-3′;β-actin上游引物序列5′-GAAGATCAAGATCAT-TGCTTCC-3′，下游引物序列5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′。Rt-PCR反应：取3组细胞各4孔，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，-80℃保存待用。按照One Step TB Green？誖PrimeScriptTMRt-PCR Kit（perfect real time）说明书加入反应液，反转录总RNA合成cDNA及进行PCR扩增。程序设置按照试剂盒说明书。反应条件：42℃ 5 min;95℃ 10 s;95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环;95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。反应结束后，用2-△△Ct法进行数据分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 24.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多个样本均数采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光倒置显微镜观察各组材料的细胞生长情况

随着时间的增加，各组细胞数量增加。见图1。

2.2 MTT法检测Regesi再生硅、Bio-OSS骨粉分别对MC3T3-E1细胞增殖的影响

各组MC3T3-E1细胞的增殖活性随培养时间的增加而升高，在培养7 d时，与对照组比较，Bio-oss骨粉实验组细胞增殖水平降低（P < 0.05）;Regesi再生硅实验组细胞增殖水平升高（P < 0.05）。见图2。

2.3 ALP活性

在培养7 d时，与对照组比较，Regesi再生硅组ALP活性升高（P < 0.05），Bio-oss骨粉实验组ALP活性差异无统计学意义（P > 0.05）。见图3。

2.4 Rt-PCR检测Runx2、OSX基因的表达

对照组比较，Regesi再生硅组成骨相关基因Runx2、OSX mRNA的表达升高（P < 0.05）;Bio-oss骨粉实验组成骨相关基因Runx2、OSX mRNA的表达差异无统计学意义（P > 0.05）。见图4～5。

3 讨论

寻找更好的骨组织再生修复材料，为患者再造健康，是生物医用材料研究的前沿和热点[3-5]。Regesi再生硅材料是由溶胶-凝胶法[6-8]制备而成的一种新型生物活性玻璃，目前还没有在临床得到应用。

成骨细胞经历了增殖、细胞外基质分化与成熟、细胞外基质矿化等阶段成骨[9-10]。本研究选用的MC3T3-E1细胞系具有极好的成骨分化潜能，是体外研究骨细胞增殖、分化与矿化的细胞模型。在细胞的生命活动中，细胞增殖与细胞分化是两个重要的方面[11]。本研究中，采用MTT法检测细胞的增殖情况，结果显示Regesi再生硅能促进成骨细胞的增殖活性，Bio-oss骨粉减弱成骨细胞的增殖活性。

在分化阶段，ALP是成骨细胞分化时分泌的酶，是成骨分化早期的标志性蛋白[12]能较客观的反映成骨细胞的分化情况[13];Runx2和Osterix是成骨细胞分化的关键转录因子，在骨发育的不同阶段发挥重要作用。Runx2是骨形成过程中最早和最具特征性的标志[14]，在成骨细胞成熟早期阶段发挥作用[15]。OSX是另一个重要的成骨细胞转录因子，影响成骨细胞的最终成熟，受Runx2的调控[16-17]，OSX只在发育中的骨组织中特异性表达，是成骨细胞分化和骨形成过程中所必需的转录因子[18]。Runx2和OSX在成骨细胞增殖、分化、转录调控过程中发挥重要作用，并且参与许多骨组织相关疾病的发生、发展[19-20]。本研究中，ALP活性检测及荧光定量PCR的结果显示：Regesi再生硅组细胞比对照组细胞ALP活性增加，可以上调成骨相关基因Runx2、OSX mRNA的表达，与对照组比较差异有明显统计学意义（P < 0.05）;Bio-oss組细胞与对照组细胞分化差异无统计学意义（P > 0.05）。

综上所述，本研究发现，与对照组比较Bio-oss骨粉会减弱成骨细胞的增殖，成骨分化能力与单纯成骨细胞培养差异不明显（P > 0.05），是目前临床应用中的较理想的支架材料;Regesi再生硅能促进小鼠成骨细胞的增殖、成骨分化，但尚未进行动物实验，在细胞水平无法准确显示Regesi再生硅对人体骨缺损的修复作用，还需要通过动物体内实验进一步验证。

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（收稿日期：2019-10.12  本文编辑：刘永巧）

[基金项目] 中国科学院动物研究所研究项目（41426040204）。

[作者简介] 贾琰（1994.2-），女，潍坊医学院2017级口腔临床医学专业在读硕士研究生;研究方向：口腔种植学。

[通讯作者] 张保荣（1979.7-），男，博士，副主任医师;研究方向：口腔种植学、牙周学。