佛山市高明区孕检人群β-地中海贫血突变筛查及KLF1功能突变分析

陈航华 张宇 刘翠娴 贺青蓉

佛山市高明區孕检人群β-地中海贫血突变筛查及KLF1功能突变分析

陈航华 张宇 刘翠娴 贺青蓉

1.广东医科大学附属高明区人民医院妇产科，广东佛山   528500;

2.广东医科大学附属高明区人民医院检验科，广东佛山   528500

[摘要] 目的 分析广东省佛山市高明区β-地中海贫血（β地贫）的突变谱及携带者频率，并分析其中KLF1基因功能突变携带者与个体胎儿血红蛋白（HbF）水平升高之间的关系。 方法 收集2017年1月～2018年10月广东医科大学附属高明区人民医院对孕妇外周血进行地中海贫血产前筛查，对于表型阳性样品进行基因诊断及阳性者配偶的表型-基因型分析，并对所有β地贫携带者进行KLF1突变筛查。 结果 共对5318名孕妇完成了地贫产前筛查，发现1387例为血液学表型阳性;后续分子诊断鉴定出649名地贫基因携带者，其中246名为β地贫携带者，4例携带KLF1突变，且该类突变的携带者HbF水平显著高于非携带者（P < 0.01）;498名配偶被召回基因诊断，87例为地贫基因阳性，其中32例β地贫突变携带者;7对夫妇为出生中重型β地贫患儿高风险。对7名孕妇的胎儿基因型产前诊断，3例被鉴定为β地贫中重型胎儿。 结论 本研究对该地区孕检人群进行了β地贫突变筛查和流行病学调查，在一定的样本空间下对高明区的地贫携带率进行了统计，并验证了KLF1功能突变与HbF升高显著相关的现象。

[关键词] β-地中海贫血;产前诊断;KLF1功能突变;基因诊断;高明区

[中图分类号] R725.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）01（c）-0017-05

Screening of population with β-thalassemia mutation and analysis of functional mutation of KLF1 in Gaoming District， Foshan City

CHEN Hanghua1   ZHANG Yu2   LIU Cuixian2   HE Qingrong1

1.Department of Obstetrics and Gynecology， Gaoming District People′s Hospital Affiliated to Guangdong Medical University， Guangdong Province， Foshan   528500， China; 2.Department of Clinical Laboratory， Gaoming District People′s Hospital of Affilated Guangdong Medical University， Guangdong Province， Foshan   528500， China

[Abstract] Objective To analyze the mutation spectrum and carrier frequency of β-thalassemia in Gaoming District， Foshan City， and the relationship between functional mutation carriers of KLF1 gene and increased fetal hemoglobin （HbF） level was also analyzed. Methods From January 2017 to October 2018， peripheral blood of pregnant women in Gaoming District People′s Hospital Affiliated to Guangdong Medical University was collected for prenatal screening of thalassemia. Gene diagnosis and phenotypic- genotype analysis were performed for phenotypic positive samples. All poor carriers were screened for KLF1 mutations. Results A total of 5318 pregnant women were screened and 1387 cases were found to be positive for hematological phenotype. Subsequent molecular diagnosis identified 649 cases of geodesic poor gene carriers， of which 246 cases were geodesic poor carriers， and 4 cases were carrying KLF1 mutations， with significantly higher HbF levels than non-carriers（P < 0.01）. 498 of the spouses were recalled for genetic diagnosis， of which 87 cases were positive for destitute gene， of which 32 cases were carriers of destitute mutation. Seven couples were at high risk for children born in moderate and heavy poverty areas. In the prenatal diagnosis of fetal genotype in 7 pregnant women， 3 cases were identified as medium and heavy fetuses. Conclusion In this study， the low-fertility mutation screening and epidemiological investigation were carried out on the pregnant screening population in this area， and the low-fertility carrying rate in Gaoming District counted under a certain sample space， and the phenomenon that KLF1 functional mutation was significantly correlated with the increase of HbF was verified.

[Key words] β-thalassemia; Prenatal diagnosis; KLF1 functional mutations; Genetic diagnosis; Gaoming District

β-地中海贫血（β地贫）是一种由于珠蛋白合成障碍而导致的遗传性血液病[1]。该病广泛分布于全球热带和亚热带地区[2]。目前β地贫的致病分子机制已被阐明，该病是由于11号染色体上HBB基因突变而导致的β珠蛋白肽链合成不足[3]。我国南方广东和广西的β地贫携带率分别高达4.20%和6.66%[4]。目前针对县市一级的地贫筛查尚缺少关于KLF1突变人群筛查的相关报道。KLF1是一个参与到β-珠蛋白基因表达转换的关键红系特异性转录因子[5-6]。发生在KLF1基因上的功能性突变，可提高胎儿血红蛋白（fetal hemoglobin，HbF），从而显著改善β地贫患者的表型[7-8]。因此，本研究拟通过对佛山市高明区孕检人群中的β地贫基因阳性样本进行KLF1基因的突变筛查，同时探讨含有KLF1基因突变的β地贫携带者在血液学表型上的差异。综上，本研究通过血液学表型筛查、血红蛋白电泳、基因检测等手段、报道了广东省佛山市高明区β地贫基因发生率，分布类型以及β地贫携带阳性个体中的KLF1基因携带率，为该地区的产前筛查、产前诊断、及地贫防控措施提供基础资料。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2017年1月～2018年10月广东医科大学附属高明区人民医院（以下简称“我院”）进行产前地中海贫血筛查的孕妇共5318例;对于地贫基因诊断阳性的孕妇，召回配偶，合计498例。因此本研究的总样本数为5816例，年龄18～43岁。本研究经我院医学伦理委员会批准，并征得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血液学表型筛查  本研究的第一队列，5318例孕妇，经我院门诊开具检查，由我院检验科对血液样本进行表型检测。包括血常规（SysmexXN-1000）和血红蛋白电泳（helenaV8），其中，判断血液学筛查阳性的标准如下：①平均红细胞体积（MCV）≤80 fL，平均紅细胞血红蛋白含量（MCH）≤27 pg;②HbA2≤2.5%为疑似α地贫;③HbA2>3.5%为疑似β地贫，同时可伴有HbF值升高（HbF>2.0%）。满足以上其中1项则判别为血液学表型筛查阳性。

1.2.2 地贫基因诊断  为系统排查静止型α地贫及β复合α地贫个体，本研究针对所有血液学筛查阳性的样品，同时进行α和β地贫基因突变的筛查。针对缺失型α地贫，采用单管多重Gap-PCR方法，检测中国人常见的3种α地贫致病突变类型，即--SEA、-3.7和 -4.2。采用寡核苷酸探针反向斑点杂交法（reverse dot blotting，RDB）对PCR扩增后的β珠蛋白基因片段进行中国人群常见的17种β地贫突变检测（广州达安生物技术有限公司）。针对β地贫突变阳性个体的KLF1功能突变筛查，采用PCR及Sanger测序的方法，在KLF1基因的5′UTR区和一号外显子共同设计1对引物;二号外显子设计3对引物;锌指结构设计2对引物;3′UTR设计1对引物，合计引物共7对。使用Chromas（版本2.6.4）软件完成Sanger测序结果判读。

1.2.3 地贫遗传咨询  出现以下任一基因型组合情况，均要求孕妇及其配偶到上一级医院做地贫产前诊断：①夫妇双方同时为β地贫携带者（中重型β地贫高风险）;②夫妇其中一方为标准型或中间型α地贫携带者，另一方为静止型，标准型α地贫携带者或中间型α地贫患者（HbH病或HbBart′s水肿胎高风险）;③夫妇其中一方为标准型α地贫携带者，另一方α复合β地贫杂合子;或夫妻双方同时为α复合β地贫杂合子（HbH病，HbBart′s水肿胎，或中重型β地贫高风险）。

1.3 统计学方法

使用SPSS 13.0对所得数据进行统计学分析，计量资料比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 孕妇及阳性案例配偶β地贫突变的频率及类型分布特征

进行筛查的5318名孕妇中，共鉴定出1387例血液学表型阳性。对其进行α和β地贫基因诊断中发现，649例为地贫基因携带者，其中246例为β地贫携带者（其中28例为β复合α的携带者），在遗传咨询中，建议所有地贫基因检测阳性孕妇的配偶前来医院检查，结果成功召回498名配偶。对这498名配偶同步进行血液学表型和地贫基因型的检测，共鉴定出87例为地贫突变阳性，其中β地贫携带者共32例;最终鉴定出7对β中重型地贫的高风险夫妇，经过对7名孕妇的产前诊断，发现其中3例胎儿为重型地贫，并成功完成了出生干预。

在β地贫突变谱上，以高明区产龄孕妇为代表的采样显示，该区主要的地贫突变种类仍是CD41-42、CD17、-28、IVS-Ⅱ-654、CD71-72等，其中CD41-42、CD17、-28、IVS-Ⅱ-654这4种突变占了该区β地贫突变总数的95%以上。见表1。

2.2 β地贫阳性案例的KLF1筛查及血液学表型关联分析

针对KLF1的编码区，5′UTR及3′UTR区域功能性突变扫描发现，246例β地贫携带者（孕妇）中共鉴定出4例KLF1功能突变阳性案例，均为二号外显子7个碱基插入所导致的移码突变（c.519_525dupCG-GCGCC）。测序结果如图1所示。经过血液学表型和基因型的关联分析发现，4例KLF1突变阳性的β地贫携带者具有显著升高的HbA2和HbF。4例KLF1阳性样本的平均HbF含量为9.52%，HbA2含量为7.48%，242例KLF1突变阴性样本的HbF水平则为0.91%，HbA2为4.80%，结果显示，KLF1阳性样本与非阳性样本之间HbF水平的独立样本t检验P值为0.00158，而HbA2水平的P值则为0.00147。提示KLF1突变对β地贫携带者个体的HbF和HbA2水平均产生影响（图2）。

2.3 針对β地贫高风险夫妇的产前诊断

本研究截至2018年10月共鉴定出7对β地贫高风险夫妇。由于β地贫为常染色体隐性遗传疾病，在夫妻双方均为携带者的情况下，双方各自将致病的等位基因传递给后代的概率均为1/2，因此，他们的后代有1/4的概率成为致病基因纯合子个体，从而罹患中重型β地贫。因此在遗传咨询中，充分告知孕妇其后代罹患严重出生缺陷的概率、原因及预防措施。建议其到上一级医院进行产前诊断和出生干预。7名孕妇均具有较好的依从性，完成胎儿基因型产前诊断，共鉴定出3例重型β地贫胎儿，均进行了有效的出生干预。7对夫妇的β基因型及胎儿的基因型。见表2。

3 讨论

β地贫是我国南方地区高发的遗传性血液病，对南方地区，特别是广东、广西、海南等省份造成了巨大的社会和家庭负担[9-11]。我国β地贫的分子基础是以β珠蛋白基因上的点突变为主，按照突变以后β珠蛋白基因的功能完全缺失和部分缺失，可分为β0突变和β+突变两类。基因型β0/β0，β0/β+，或β+/β+，均可导致β地贫的发生。目前对β地贫最有效的防控措施，就是通过人群普筛和分子诊断，确定高风险夫妇，实施准确有效的产前诊断和出生干预。因此，了解本地区β地贫的突变谱，携带率，对地区医院及妇幼系统对β地贫的防控具有重要的参考意义。过去的研究中，有学者已针对广东省的部分地区，如东莞、梅州、珠海、中山等，进行了β地贫基因的筛查，其携带率与全省范围的流行病学调查结果大致吻合，对本地区开展孕检人群的采样和分析提供了参考[12-15]。本研究针对高明区5318名孕妇及其中498名配偶的地贫筛查和分子诊断中，共鉴定出246例孕妇为β地贫携带者，携带率为4.63%，略高于过去对广东省的整体β地贫携带率的报道（4.20%）。并且，针对成功被召回的配偶，完成了系统的地贫分子诊断，检出全部的高风险夫妇，合计7对，实现了在该研究人群内的β中重型地贫患儿“零出生”。

β地贫患者临床表型多样性的遗传学机制研究，逐渐成为国内外研究团队的关注对象。发生在BCL11A、KLF1、MYB-HBS1L基因间区的功能性变异，先后被报道与HbF的升高显著相关而缓解β地贫患者的临床表现严重程度[5，16-17]。其中，KLF1基因区上的错义突变及锌指结构上的功能变异，被报道为对我国南方人群β地贫患者的表型缓解效应最大的因素[18]。携带KLF1单等位基因功能突变的β0/β0患者，均显现较高的HbF水平，从而表现出中间型地贫症状。该现象显示，KLF1是β地贫精确诊断和基因治疗的重要靶点[19-20]。

进行高发遗传病的人群普筛及有效的高风险夫妇跟踪，是提高出生人口素质，降低出生缺陷发生率的重要措施。佛山市统计年鉴显示，2017年高明区出生人口数为7283人，假设在没有人群筛查和优生优育措施的情况下，依据本研究得到该地区β地贫携带率约为4.63%计算，则新生儿中β地贫患儿的预计出生数为7283×0.0463×0.0463，约为15名。这些患儿的出生将对家庭造成沉重的经济和精神负担，因此，针对新婚夫妇提供免费的地贫防控相关知识，安全教育，及地贫筛查和临床检测，将极大地减少乃至完全杜绝重型地贫患儿地出生，该项研究有望为地方政府的市一级、区一级防控提供有效的数据参考。

[参考文献]

[1]  Taher AT，Cappellini MD. How I manage medical complications of β-thalassemia in adults [J]. Blood，2018，132（17）：1781-1791.

[2]  Saliba AN，Moukhadder HM，Harb A，et al. Causes of hospital admission in β-thalassemia （CHAT） in Lebanon from 1995 to 2015：A pilot retrospective study from a tertiary care center [J]. Am J Hematol，2017，92（12）：E652-E653.

[3]  Cao A，Galanello R. Beta-thalassemia [J]. Genet Med，2010，12（2）：61-76.

[4]  Shang X，Peng Z，Ye Y，et al. Rapid Targeted Next-Generation Sequencing Platform for Molecular Screening and Clinical Genotyping in Subjects with Hemoglobinopathies [J]. EbioMedicine，2017，23：150-159.

[5]  Liu D，Zhang X，Yu L，et al. KLF1 mutations are relatively more common in a thalassemia endemic region and ameliorate the severity of β-thalassemia [J]. Blood，2014，124（5）：803-811.

[6]  Norton LJ，Funnell APW，Burdach J，et al. KLF1 directly activates expression of the novel fetal globin repressor ZBTB7A/LRF in erythroid cells [J]. Blood Adv，2017，1（11）：685-692.

[7]  Wienert B，Martyn GE，Kurita R，et al. KLF1 drives the expression of fetal hemoglobin in British HPFH [J]. Blood， 2017，130（6）：803-807.

[8]  Dai Y，Chen T，Ijaz H，et al. SIRT1 activates the expression of fetal hemoglobin genes [J]. Am J Hematol，2017， 92（11）：1177-1186.

[9]  裴元元，冉健丛，潇怡，等.不同基因型轻型β-地中海贫血患者血液学特征[J].实用医学杂志，2018，34（10）：1691-1692，1697.

[10]  Bonifazi F，Conte R，Baiardi P，et al. Pattern of complications and burden of disease in patients affected by beta thalassemia major [J]. Curr Med Res Opin，2017，33（8）：1525-1533.

[11]  McGann PT，Nero AC，Ware RE. Clinical Features of β-Thalassemia and Sickle Cell Disease [J]. Adv Exp Med Biol，2017，1013：1-26.

[12]  姚倩瑜，李铭臻，邱建国，等.广东省东莞地区地中海贫血产前筛查及产前诊断体系的建立[J].中国基层医药，2013，20（7）：964-966.

[13]  黄烁丹，邹婕，蒋玮莹.广东省梅州地区地中海贫血的调查报告[J].广东医学，2004，25（1）：82-83.

[14]  王小金，肖鸽飞，郭晓莉，等.广东省珠海市户籍人群中β-地中海贫血的分子流行病学调查[J].中国优生与遗传杂志，2003，11（5）：10-11，38.

[15]  黄健云，莫和国，商璇，等.中山市小榄地区β地中海贫血产前筛查和产前诊断状况[J].广东医学，2016，37（11）：1695-1698.

[16]  Orkin SH，Bauer DE. Emerging Genetic Therapy for Sickle Cell Disease [J]. Annu Rev Med，2019，70：257-271.

[17]  Makani J，Menzel S，Nkya S，et al. Genetics of fetal hem-oglobin in Tanzanian and British patients with sickle cell anemia [J]. Blood，2011，117（4）：1390-1392.

[18]  Chen D，Zuo Y，Zhang X，et al. A Genetic Variant Ameliorates β-Thalassemia Severity by Epigenetic-Mediated Elevation of Human Fetal Hemoglobin Expression [J]. Am J Hum Genet，2017，101（1）：130-138.

[19]  Perkins A，Xu X，Higgs DR，et al. Krüppeling erythropoiesis：an unexpected broad spectrum of human red blood cell disorders due to KLF1 variants [J]. Blood，2016，127（15）：1856-1862.

[20]  Wienert B，Martyn GE，Kurita R，et al. KLF1 drives the expression of fetal hemoglobin in British HPFH [J]. Blood，2017，130（6）：803-807.

（收稿日期：2019-05-04  本文編辑：封   华）

[基金项目] 广东省佛山市卫生和计划生育局医学科研立项课题（20180395）。