浓香型白酒发酵新老窖泥理化因子和 原核微生物群落结构差异分析

张会敏，王艳丽，孟雅静，王银辉，李安军，王志强，张治洲，邢新会

（1.安徽省固态发酵工程技术研究中心，安徽 亳州 236820；2.清华大学化工学院，北京 100084；3.哈尔滨工业大学海洋科学与技术学院，山东 威海 264209）

中国浓香型白酒发酵是一个重要的微生物发酵研究领域，其在窖池中进行。窖池窖泥中丰富的菌群发酵形成丰富的代谢产物，对白酒中呈香味风味物质的形成具有重要作用[1]。酿酒界有句话“千年老窖，万年糟，好酒全凭窖池老”，经验性地说明了窖泥的窖龄与白酒发酵质量的相互关系。Wang Xueshan等[2]通过主坐标分析发现，酒醅原核菌群在发酵中期与大曲原核菌群的差异有增大趋势，而在整个发酵过程中则与窖泥原核菌群维持恒定关系，说明窖泥与酒醅之间存在稳定的相互关系。Deng Bo等[3]通过变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）分析发现不同窖龄的窖泥菌群同时存在合作和抑制关系，这种共存的复杂关系导致窖泥菌群结构的进化演变。Tao Yong等[4]通过焦磷酸高通量测序研究了四川某浓香型白酒公司1、10、25 a和50 a窖龄窖泥中的原核微生物群落变化，发现随着窖泥窖龄从1 a增加到25 a，窖泥菌群丰度逐渐增加，而25 a和50 a窖龄的窖泥菌群结构无显著差异。Liu Maoke等[5]通过Illumina高通量测序进一步发现40 a窖龄与400 a窖龄的窖泥菌群结构差异不明显。由此可知，在周期性的发酵模式影响下，窖泥菌群各种菌属之间至少需要25 a复杂的合作与竞争作用时间，窖泥菌群结构才基本达到稳定状态，也就是业内所说的老熟状态。

在窖泥菌群老熟过程中，窖泥菌群与其所在的理化环境相互适应，相互影响，共同转变。窖泥老熟需要一个稳定的过程，如果维护不当也会造成窖泥退化。在实际生产中，根据窖泥状态可以将其分为不同等级，Hu Xiaolong等[6]将窖泥分为退化、正常和优质3 个等级。比较分析不同等级窖泥[6]与不同窖龄窖泥[4]的理化性质发现：退化窖泥[6]与新窖泥（10 a以下）[4]的pH值、乳酸含量等理化指标更相近；优质窖泥[6]与老窖泥[4]的理化指标更接近。因此，弄清楚窖泥的正常老熟过程对避免窖泥退化具有重要意义。Liang Huipeng等[7]对分别来自四川省和安徽省的窖泥菌群进行研究，发现两者退化等级窖泥的菌群组成差异不大，而两个地区的优质窖泥的菌群结构差异明显。说明窖泥老熟过程受当地环境的影响，这可能也是目前来自不同产地的众多浓香型白酒风味差异的原因。

本研究选取安徽省某著名浓香型白酒公司的新窖池（4 a窖龄）和老窖池（50 a以上窖龄）的窖泥作为研究对象，分析新老窖泥的理化性质差异、细菌菌群结构差异、内部菌属之间的关系差异，并建立窖泥理化性质与细菌菌群结构之间的典型相关分析（canonical correlation analysis，CCA），以期深入解读新老窖泥菌群差异的原因，建立窖泥老熟理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

窖泥样本 安徽某知名浓香型白酒企业；Omega土壤DNA提取试剂盒（D5625） 美国Omega BioTek公司； AP-GX-50凝胶回收试剂盒 美国Axygen公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FE20 pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；6890气相色谱仪（配CP-WAX 57 CB色谱柱（50 m×0.25 mm，0.2 μm）） 美国Agilent公司；Acquity超高效液相色谱（配二极管阵列检测器和HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）） 美国Waters 公司；ICS5000+离子色谱仪（配ICS-5000+-DC电导检测器） 美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥样本采集

采用九点取样法[8]取窖泥样本12 个。6 个新窖泥样本（窖龄4 a），标记为PM_N1～PM_N6；6 个老窖泥样本（窖龄≥50 a），标记为PM_O1～PM_O6。置于无菌袋中，于-80 ℃贮存，待用。

1.3.2 理化性质分析

采用烘干法[5]检测窖泥水分；使用pH计（FE20）检测窖泥pH值（将新鲜窖泥与去离子水按照1∶3质量体积比混匀静置后检测[6]）；采用紫外分光光度计检测铵态氮含量[9]；采用油浴法检测腐殖质含量[9]；采用滴定法检测总酯含量[10]。

将新鲜窖泥与15%甲醇溶液按照1∶9（g/mL）混匀，30 ℃超声处理40 min后，0.22 μm滤膜过滤得到浸提液，用于检测其中有机酸醇酯含量。使用气相色谱检测挥发性有机酸酯和乙醇含量：进样量1 μL；柱流速 1 mL/min；进样口温度250 ℃；分流进样，分流比30∶1；柱温箱程序升温条件为：初始温度35 ℃，以2 ℃/min升温速率升温至60 ℃，保持4 min，再以6 ℃/min速率升温至195 ℃，保持20 min；氢火焰离子检测器温度250 ℃。采用液相色谱方法检测非挥发性乳酸含量：进样量1 μL；流动相为0.02 mol/L的KH2PO4溶液；柱流速 0.1 mL/min；检测波长208 nm；柱温30 ℃。

将新鲜窖泥与去离子水按照1∶1 0（g/m L）混匀，8 000 r/min离心5 min，取上清液过滤，用离子色谱仪检测其可溶性K+与Ca2+浓度。离子色谱柱为IonPacTMCS12A RFICTM（4 mm×250 mm）；进样量25 μL；柱流速1 mL/min；柱温30 ℃；流动相为20 mmol/L 甲基磺酸溶液，等浓度洗脱；检测器为ICS-5000+-DC电导检测器。

1.3.3 DNA提取与Illumina高通量测序

使用Omega土壤DNA提取试剂盒（D5625）提取窖泥DNA。然后，通过上海派森诺生物科技股份有限公司进行Illumina MiSeq高通量测序。引物为：520F（5’-7 bp barcode+GCA CCT AAY TGG GYD TAA AGNG-3’）和802R（5’-TAC NVG GGT ATC TAA TCC-3’），扩增16S V4区。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）25 μL扩增体系：0.25 μL Q5高保真DNA聚合酶，5 μL 5×PCR Buffer，5 μL 5×High GC Buffer，2 μL dNTP（2.5 mmol/L），2 μL DNA模板，1 μL上下游引物（10 μmol/L），8.75 μL双蒸水。PCR扩增程序：98 ℃完全变性2 min；25 个循环扩增：98 ℃变性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s；72 ℃完全延伸5 min。PCR扩增产物纯化（AP-GX-50凝胶回收试剂盒）后，荧光定量（QuantiT PicoGreen dsDNA Assay Kit），构建克隆文库（TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit，Illumina）。经过Agilent 2100 Bioanlyzer确定DNA文库合格后，进行Illumina MiSeq双向测序（MiSeq Reagent Kit V3）。

1.3.4 测序数据处理与统计学分析

去掉长度小于150 bp或者大于300 bp、模糊碱基数大于1、同聚碱基数目大于8、引物错配大于1 bp的序列（QIIME，v1.8.0）；双向拼接（FLASH软件[11]v1.2.7）序列、剔除嵌合体（USEARCH，v5.2.236）得到优质序列。UCLUST聚类（97%相似度）优质序列得到各可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU），认定各OTU中丰度最高的序列为其代表序列。在80%可信度水平，使用Greengene数据库（Release 13.8）注释各代表序列的结果即为OTU的注释结果。通过Mothur软件（1.36.1）得到Shannon、Chao 1等指数。基于OTU列表的主成分分析、主要OTU之间的Pearson相关性分析和CCA均通过R语言（R3.3.2）实现。窖泥菌群组成的差异显著性分析通过Metastats检测实现[12]。窖泥样本理化因子之间的差异显著性分析通过SPSS（24.0）方差分析（ANOVA）实现。

2 结果与分析

2.1 窖泥样本的理化性质

新老窖泥的水分、腐殖质、己酸、丁酸、乳酸乙酯和乙酸乙酯含量不具有显著性差异；两者pH值、铵态氮、乙醇、乙酸、丙酸、乳酸、己酸乙酯、K+、Ca2+和总酯含量具有显著性差异（表1）。老窖泥的pH值、铵态氮、乙酸和K+含量显著高于新窖泥；而新窖泥中乙醇、丙酸、乳酸、己酸乙酯、可溶性Ca2+和总酯含量则显著高于老窖泥。新老窖泥之间的理化性质存在差异，说明新老窖泥菌群所处的生存环境存在差异，该差异体现了窖泥菌群通过其代谢作用随着时间的推移对窖泥的作用效应。

表 1 新老窖池窖泥样本的理化性质Table 1 Physicochemical properties of young and old PM samples

2.2 窖泥原核微生物群落的α多样性

表 2 新老窖泥细菌群落丰度和多样性参数Table 2 Bacterial community richness and diversity indices of young and old pit mud samples

通过Illumina MiSeq高通量测序，得到580 157 条平均长度为207 bp的优质序列，平均38 795～78 904 条/样本。对所有样本二次抽平为38 457 条，进行后续分析。OTU聚类（97%相似度）得到2 559 个OTU（≥3 条序列/OTU），OTU平均611～1 044 个/样本。每个样本的测序覆盖率大于98%，说明测序数目足够，测序序列可以代表其菌群组成。得到注释（门、纲、目、科、属）的序列大于99%，无法得到注释的序列低于0.08%，说明对窖泥中大量的未培养菌也充分实现系统分类。老窖泥菌群的Shannon指数显著大于新窖泥，说明老窖泥的菌群多样性和丰度大于新窖泥，与Tao Yong[4]和Liu Maoke[5]等的研究结论一致。老窖泥菌群的Chao 1指数略低于新窖泥菌群的Chao 1指数，说明老窖泥的菌群物种数目略低于新窖泥，但不显著（表2）。

2.3 窖泥原核微生物群落的β多样性

对OTU注释，总共得到43 个门，其中41 个细菌门，2 个古菌门。分析平均相对丰度，厚壁菌门（Firmicutes）在老窖泥（69.0%）和新窖泥（73.5%）中，均为绝对优势菌门。与新窖泥相比，老窖泥中，拟杆菌门（Bacteroidetes，10.4% vs 3.7%）、互养菌门（Synergistetes，7.2% vs 0.27%）和广古菌门（Euryarchaeota，6.1% vs 1.0%）具有显著优势；与老窖泥相比，新窖泥中变形菌门（Proteobacteria，15.2% vs 1.58%）和放线菌门（Actinobacteria，4.2% vs 0.59%）具有显著优势。以上6 个门在老窖泥或者新窖泥中相对丰度超过1%，为优势门，其序列数占总测序数的96.3%，占每个样本序列数的92.2%～99.1%。排名20 名以后的门，其总序列数小于总测序数的0.01%，为稀有菌门，如脱铁杆菌门（Deferribacteres）。含量最多的前20 个门相对丰度如图1所示。

图 1 窖泥中丰度最高的20 个门的相对丰度Fig. 1 Relative abundances of the top 20 phyla in PM

对OTU注释，共得到306 个属，注释度为76.87%，其余序列只能不同程度地注释到门、纲、目、科等级别。相对丰度超过1%的优势菌属为乳酸菌属（Lactobacillus）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、喜热菌属（Caloramator）、梭菌属（Clostridium）、氨基酸菌（Aminobacterium）、克雷伯菌属（Klebsiella）、互营单胞菌属（Syntrophomonas）、甲烷囊菌属（Methanoculleus）和沉积菌属（Sedimentibacter）（图2）。

对12 个窖泥样本的OTU列表进行主成分分析聚类（图3），结果表明，新老窖泥样本分别聚类，两者在第1主成分（74.97%）的差异非常明显，而在第2主成分（13.29%）的差异较小。两组样本组内聚类效果相比，老窖泥样本的聚类更集中，说明老窖泥菌群之间一致性更好，即该研究中老窖泥菌群已经达到老熟状态[4]。而新窖泥样本聚类分散，说明各新窖泥菌群之间差异性比较大。老窖泥菌群一致性好于新窖泥菌群的一致性，与Liang Huipeng等[7]的结论一致。

图 2 窖泥中丰度最高的20 个属的相对丰度Fig. 2 Relative abundances of the top 20 genera in PM

图 3 新老窖泥菌群OTU组成的主成分分析聚类图Fig. 3 Cluster analysis of the OTU composition of old and young PMs based on principal component analysis

鉴于新老窖泥菌群聚类（图3）分为两组，分组分析相对丰度最多的20 个属在新老窖泥中的菌种组成（图4）。其20 个属中，12 个属的组成具有显著差异。Ruminococcus和Lactobacillus在新老窖泥中相对丰度都很大，前者差异不显著，后者差异显著，其在新窖泥中的平均相对丰度（39.69%）远高于老窖泥中的平均相对丰度（5.97%）。而相对丰度排名4～8的Clostridium、Aminobacterium、Syntrophomonas、Methanoculleus和Sedimentibacter在老窖泥中的平均相对丰度比新窖泥中的平均相对丰度高5.3%～10.3%，其在新老窖泥中的组成差异可能和两者的代谢功能差异有密切关系。Clostridium，如现已知克氏梭菌[13]与浓香型白酒中典型风味物质己酸的产生有关。Aminobacterium参与降解氨基酸[14-15]，很可能与提供窖泥菌群丰富的铵态氮有关。Methanoculleus参与代谢短链脂肪酸，产生甲烷，参与提高浓香型白酒的酿酒质量[16]。Sedimentibacter可以降解氨基酸[17]，有可能与生成铵态氮有关。

图 4 新老窖泥样本相对丰度最高的20 个属的相对丰度Fig. 4 Relative abundances of the top 20 genera in young and old PMs

2.4 新老窖泥中主要OTU之间的相关性分析

图 5 新窖泥中数量最多的前50 个OTU之间的Pearson相互关系图Fig. 5 Pearson’s r correlation among the top 50 OTUs in young PM samples

新窖泥中数量最多的50 个OTU（占82.35%）之间的Pearson关系如图5所示。图中显示了OTU的排名与注释信息，如图5中第1个OTU，“BN24_denovo218_g_Methanocorpusoculum”即为新窖泥中数量排名第24的OTU，注释信息为Methanocorpusoculum属。图中下划线标注的为新老窖泥所共有的14 个OTU，占新窖泥的59.17%。根据各OTU之间的相关关系，分为I组（56.42%）与II组（25.93%），组内OTU呈强烈正相关，而组间呈负相关。I组可以分为两个小组： I（A）与I（B）组，小组内部OTU呈正相关，而彼此之间呈现微弱的相关关系。I（B）组中，含有一些排名比较靠前的OTU，比如排名第1（BN1_denovo2919_g_Lactobacillus）与排名第2（BN2_denovo3167_g_Ruminococcus）的OTU，两个OTU的序列总数高达44.51%。尽管I（A）组中与老窖泥共有的OTU数目比较多，不过序列比例很低（3.8%）。推测I组和II组的OTU在组内呈现协同关系，而两组之间呈现竞争/拮抗关系。

图 6 老窖泥中数量最多的前50 个OTU之间的Pearson相互关系图Fig. 6 Pearson’s r correlation among the top 50 OTUs in old PM samples

老窖泥中数量最多的50 个OTU（72.63%）之间的Pearson关系如图6所示。首先，老窖泥OTU之间的关系相对复杂。根据OTU之间的相互关系，可以将老窖泥OTU分为5 个小组（A、B、C、D、E），组内OTU呈正相关，而组间既有正相关又有负相关。其次，5 组OTU的分布比较均匀。老窖泥中新老窖泥所共有的OTU，其比例由59.17%变为40.27%，有所下降，其余OTU的增加说明老窖泥中菌种的变化。有些细菌尽管属名没有发生改变，其菌种及其功能已经发生了改变。新窖泥中排名第1的OTU（BN1_denovo2919_g_Lactobacillus）在老窖泥中排名第7，新窖泥排名第2的OTU（BN2_denovo3167_g_Ruminococcus）在老窖泥排名变为第1。两者之间的关系也由新窖泥中的正相关变为老窖泥的负相关关系。老窖泥5 组窖泥菌群之间既有协同关系（相互依存）又有竞争关系。Deng Bo等[3]PCR-DGGE得出结论：窖泥菌群内部合作与限制关系共存促进了窖泥菌群的进化演变。比较图5与图6，老窖泥菌群内部既相互依存又相互竞争的关系更强，即随着窖泥的老熟，窖泥菌群之间的关系更加复杂融合。

2.5 窖泥理化性质与菌群之间的CCA

图 7 新老窖泥差异显著的10 个理化因子与窖泥菌群之间的CCA关系图Fig. 7 Canonical correlation analysis of the 10 physicochemical factors that significantly differed between young and old PMs versus microbial communities in them

新老窖泥具有显著性差异的理化因子与窖泥菌群OTU之间的CCA如图7所示，2 个主成分可以解释56.78%微生物菌群的变异。乙醇、乳酸、丙酸、己酸乙酯、总酯和可溶性Ca2+含量与新窖泥菌群呈正相关，表明与老窖泥相比，新窖泥中乙醇、乳酸、丙酸、己酸乙酯、总酯和Ca2+含量相对较多，推测新窖泥菌群中降解乙醇、酸（乳酸、丙酸）和酯的菌相对较少，酸和醇的存在，形成了更多的酯，如己酸乙酯在新窖泥中含量相对老窖池较多，与陈彬等[18]的研究结果一致。乙酸、铵态氮、pH值和K+含量与老窖泥菌群呈正相关，表明老窖泥中乙酸、铵态氮和pH值相对较高，说明老窖池中代谢形成乙酸、铵态氮的菌较多，同时对酸的降解和铵态氮的合成使得老窖池中pH值升高。新窖泥中存在更多的Ca2+，且已知新窖泥和退化窖泥中常有乳酸钙结晶析出的情况[19]发生，推测可能与新窖泥的偏酸性环境有关，尤其是其中存在大量的乳酸，促进了窖泥环境中固态钙与乳酸之间发生酸解，产生更多游离态Ca2+，同时生成的乳酸钙由于溶解度较低而析出。老窖泥中较高浓度的K+的存在有可能与其中细菌通过运输系统积累K+有关[20]。

3 讨论与结论

各种理化性质中，老窖泥的pH值、铵态氮、乙酸和K+含量相对较高；新窖泥的乙醇、丙酸、乳酸、己酸乙酯、可溶性Ca2+和总酯含量相对较高。新老窖泥理化性质的差异造成了新老窖泥菌群生存环境的差异。新窖泥中Lactobacillus的相对丰度（39.69%）几乎是老窖泥中相对丰度（5.97%）的7 倍。与新窖泥相比，老窖泥中丰度排名第4～8位的Clostridium（2.87% vs 8.16%）、Aminobacterium（0.015% vs 10.26%）、Syntrophomonas（0.34% vs 7.42%）、Methanoculleus（0.25% vs 7.37%）和Sedimentibacter（0.62% vs 6.43%）相对丰度差异百分比总和达到35.54%，弥补了老窖泥中缺失的Lactobacillus相对丰度。新老窖泥细菌菌群的组成存在巨大差异必然导致新老窖泥菌群的代谢功能存在差异。比如，Lactobacillus代谢产生乳酸且耐酸[21]，很可能与新窖泥中的高乳酸含量和低pH值特性有关；Aminobacterium[14-15]和Sedimentibacter[17]具有降解氨基酸的功能，很可能与老窖泥中铵态氮的增加有关。老窖泥中含量相对较高的Clostridium[22]、Aminobacterium[14]、Syntrophomonas[23]、Sedimentibacter[17]、Methanoculleus[24]菌属，其适宜生存pH值比乳酸菌高，所以更宜在pH值稍高的老窖泥中生存。本研究通过高通量测序得到的新老窖泥的菌群结构与Liang Huipeng等[7]通过PCR-DGGE得到的菌群规律基本一致，除本研究老窖泥中Actinobacteria相对丰度显著低于新窖泥这一点，而Liang Huipeng等[7]指出老窖泥中Actinobacteria相对丰度高于新窖泥，并可以将其作为区分新老窖泥的依据。不过，本研究认为Liang Huipeng等[7]通过PCR绝对定量得到的数据与本研究得到的相对定量数据并无本质差异。很可能老窖泥中Actinobacteria的绝对含量值较高[25]，而新窖泥中Actinobacteria的相对定量值较高。

新老窖泥菌群组成的转变除直接表现在种属含量变化，还有其内部关系变化和代谢功能变化。新窖泥菌群内部关系相对简单，主要表现在其中相对丰度占绝对优势的乳酸菌所在的I组（56.42%）与II组（25.93%）呈强烈负相关。其可能与乳酸菌的产乳酸和产细菌素[26-27]功能有关，乳酸和细菌素的抑菌功能有助于乳酸菌在菌群竞争中占优势。同时低pH值环境不适于不耐酸菌株的生存。老窖泥菌群的内部关系相对复杂。新窖泥中排名第1的OTU（BN1_denovo2919_g_Lactobacillus）在老窖泥中排名第7，相对丰度由31.67%变为2.88%，尽管其所在的E组与其余各组之间多呈负相关，但其含量太少，影响较小。新窖泥排名第2的OTU（BN2_denovo3167_g_Ruminococcus），在老窖泥排名第1，其与BN1_denovo2919_g_Lactobacillus在新窖泥中的正相关转变为老窖泥中负相关。两者相关关系的改变可能与代谢功能的转变有关。现已知瘤胃菌科的某些菌属[28-29]在pH 5.0～6.5具有降解乳酸生成己酸的功能。有些乳酸菌如L. buchneri，可以在pH值低于5.8的条件下降解乳酸生成乙酸和1,2-丙二醇[30]。有些梭菌如克氏梭菌[31]，在pH 5.5～7.5具有以乙醇和乙酸为碳源生成己酸的功能。随着窖泥老熟，pH值逐渐升高，糖类匮乏但乳酸丰富，使得各种菌共同降解乳酸，成为竞争关系。同时，降解乳酸的行为又促进了pH值的进一步升高。另外，一些厌氧菌在与甲烷菌共存时降解脂肪酸生成乙酸和氢气[32]， 两者为协作关系。甲烷菌被认为是浓香型老窖泥的标志性菌[33]，老窖泥中很多菌与甲烷菌具有正相关关系 （图6）。同时，甲烷菌等产气菌产生的厌氧气体为窖泥中的厌氧菌创造了更适宜的厌氧生存环境。最终，乳酸菌在老窖泥的菌群竞争中趋于劣势。

窖泥老熟过程中，窖泥菌群逐渐适应并改造理化环境，其自身也发展壮大。现已知，安徽北部地区浓香型窖池，50 a窖龄窖泥的细菌总量比10 a窖龄窖泥的细菌总量多4 个数量级[25]。窖泥菌群数量越多，其代谢功能越强。窖泥中营养物质主要来源于黄水。与新窖泥菌群呈正相关的乳酸、乙醇、丙酸和己酸乙酯黄水中含量丰富，说明新窖泥菌群对各组分的代谢能力差；而乙酸和铵态氮等二次代谢产物与老窖泥菌群正相关，说明老窖泥菌群代谢功能强，其中相应代谢产物含量较多。以己酸乙酯为例，其由己酸和乙醇酯化形成。老窖泥菌群降解己酸和乙醇的功能强，使己酸乙酯的酯化平衡向分解方向进行。所以，老窖泥中己酸乙酯含量相对较少。老窖泥中总酯含量相对较少，也是同样的原因。一些理化性质，如pH值，与窖泥菌群的相关性分析结果也正体现了窖泥菌群的作用结果。

综上所述，在周期性发酵作用的影响下，窖泥菌群的变化与理化环境的变化相互适应，相互影响，共同转变。新老窖泥理化性质的差异体现了窖泥菌群对窖泥的作用效应。在窖泥菌群作用过程中，其代谢功能也逐渐发生适应性改变。本研究深入解读新老窖泥菌群的差异并分析其转变原因，为窖泥的改良提供了理论依据。