发酵罐结构对浙江玫瑰醋品质的影响

方冠宇，穆晓静，蒋予箭

（浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310018）

浙江玫瑰醋是江浙一带的传统调味品，有着悠久的生产历史。玫瑰醋生产一年只投料一次，大米经浸米、蒸饭、发花、冲缸放水发酵、后熟、压榨、灭菌等生产步骤需要耗时达6 个月之久，整个生产过程以天然发酵、手工操作为主[1-2]，品质难控制、劳动强度大、规模效益很差[3]。随着劳动力成本的不断提高，急需寻求能有效替代传统手工生产工艺的机械化生产方式。

传统发酵食品一般采用纯手工酿造工艺[4-5]，为提高生产效率，很多企业对传统发酵食品的生产工艺进行了机械化改进。镇江香醋实现了微机集散控制系统制酒醪，实现了大罐发酵，对糯米粉碎蒸煮实现了机械化和连续化，对蒸煮、液化、糖化、冷却、发酵各个环节的温度时间实施自动控制，改变了传统酒醪生产随季节变化易产生的不稳定性，用冷却设备调节室温和发酵温度，实现了酒醪常年生产质量稳定[6]。洪厚胜等[7]通过添加糖化曲和多菌协调发酵改善风味，实现了米醋的半连续发酵。刘选成等[8]利用数字化酿造工艺管理系统在浓香型白酒生产中应用，实现了浓香型白酒机械化、自动化和智能化生产。刘杰等[9]利用高温糖化酵母和干酵母实现了黄酒机械化生产。

由于浙江玫瑰醋独特的生产工艺，搅拌方式对其品质会有很大的影响。不同的搅拌方式以及搅拌频率对发酵过程会有不同的影响[10-11]。Goksel等[12]用通气法对发酵液进行搅拌，发现搅拌效果良好；Karim等[13]研究发现，在不同条件下，回流搅拌法和机械搅拌法对厌氧发酵的影响不同；阮富升等[14]曾尝试用自吸式发酵生产玫瑰醋，但其成品的色泽及风味均与传统方法生产的玫瑰醋有显著差异。本研究设计了回流搅拌发酵罐、气动搅拌发酵罐和机械搅拌发酵罐，对浙江玫瑰醋冲缸放水后，进行机械化酿造，并对发酵结束后浙江玫瑰醋的理化指标、有机酸、氨基酸、挥发性成分及感官指标进行测定分析，得出不同机械化酿造工艺对浙江玫瑰醋理化指标和风味的影响，为浙江玫瑰醋实现机械化生产提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

籼米产自安徽滁州。

乳酸、丙酸、甲酸、乙酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、L-酒石酸、α-酮戊二酸、草酸（纯度＞99%） 国药集团化学试剂有限公司；2-乙基丁酸、乙醇、乙酸、乙酸乙酯、苯甲醛（均为色谱纯） 美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

LC-2010AHT高效液相色谱 日本岛津仪器公司；UPWS-1-60D超纯水设备 杭州永洁达净化科技有限 公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；85 μm PA固相微萃取头 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 浙江玫瑰醋传统酿造工艺

以籼米为原料，常温浸米7 d（隔天换水），常压蒸饭（控制出饭率220%）；每缸投入饭220 kg，搭窝，常温（5 月份）发花16 d；发花结束时，按米-水质量比1∶3冲缸放水，进行为期4 个月左右的发酵，当酸度不再上升时，添加3%食盐，进行后熟。

1.3.2 实验设计

本研究在浙江玫瑰醋冲缸放水之后，选取回流搅拌、气动搅拌和机械搅拌3 种发酵罐对玫瑰醋进行发酵，回流搅拌发酵罐、机械搅拌发酵罐、气动搅拌发酵罐和传统发酵缸装液量均为1 000 L，发酵罐设计见图1。

图 1 发酵罐设计图Fig. 1 Design drawing of fermenters

对每一种发酵罐的搅拌频率进行探索（3 d 1 次、5 d 1 次、7 d 1 次），以传统方法酿造的玫瑰醋为发酵过程对照。实验设计见表1，实验流程见图2。

表 1 发酵罐生产浙江玫瑰醋实验方法设计（n＝3）Table 1 Experimental design for producing Zhejiang rosy vinegar with different fermenters (n = 3)

图 2 实验流程图Fig. 2 Flow chart of the experiment

1.3.3 产醋得率的测定

总酸含量测定参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》，得率以1 kg大米产醋质量计。

1.3.4 有机酸高效液相色谱测定条件

Inertsil ODS-3色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相5%甲醇-95% 6 g/L磷酸二氢铵（pH 2.60）；流速0.8 mL/min；进样体积5 μL；柱温30 ℃；紫外检测器；检测波长210 nm。

1.3.5 挥发性风味物质的测定

气相色谱条件：DB-WAX色谱柱（60 m×0.25 mm，0.5 μm）；进样口温度240 ℃，不分流进样，载气为氦气，恒流模式，柱流速1 mL/min；柱温：30 ℃保持6 min，以2 ℃/min升到140 ℃，然后以4 ℃/min升到220 ℃，保持10 min。

质谱条件：电子电离源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，质量扫描范围33～500 u。

将内标物2-乙基丁酸溶液和乙醇、乙酸、乙酸乙酯、苯甲醛混合标样等体积混合后，吸取100 μL加入到10 mL醋样中，计算各香气组分的相对校正因子，得出各组分的保留时间和峰面积。相对校正因子（fi）和待测风味物质含量的计算如式（1）、（2）所示：

式中：ΔWi和ΔAi分别为组分标品i的增加含量和对应增加峰面积；Ws和As分别为内标物s含量与峰面积。

式中：Wi和Ai分别是被测组分含量与峰面积；Ws和As分别为内标物含量与峰面积。

1.3.6 感官鉴定

选取1 0 人（酿醋企业员工5 人，实验室人员5 人），按要求进行培训。对玫瑰醋各项指标进行打分，最好为10 分，最差为0 分，取平均值[15]。

1.4 数据分析

采用E x c e l 等软件对数据进行统计分析，折线图、柱状图等采用采用Origin 8进行绘制，聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）以及图形绘制采用SIMCA-P软件。

2 结果与分析

2.1 发酵结束浙江玫瑰醋得率分析

表 2 发酵结束玫瑰醋得率Table 2 Yield of rosy vinegar produced using different fermenters with different stirring frequencies

不同发酵罐的搅拌方式和搅拌频率对浙江玫瑰醋发酵过程有显著影响，为探究不同发酵罐以及不同搅拌频率对浙江玫瑰醋得率的影响，将发酵结束的玫瑰醋换算成4 g/L的成品醋，计算浙江玫瑰醋的得率。由表2可以看出，2-2和3-2组玫瑰醋的得率高于传统玫瑰醋，说明用气动搅拌发酵罐和机械搅拌发酵罐，搅拌频率为5 d 1 次生产浙江玫瑰醋可以提高浙江玫瑰醋的得率。机械搅拌发酵罐搅拌频率为7 d 1 次生产玫瑰醋的得率与传统玫瑰醋相近。采用回流搅拌发酵罐生产浙江玫瑰醋其得率都显著低于传统玫瑰醋，因此不适宜用回流发酵罐生产浙江玫瑰醋。

浙江玫瑰醋的发酵是一种静态表面发酵过程，其表面的菌膜在玫瑰醋的醋酸发酵中起重要作用。大量研究表明菌膜是由醋酸菌产生的细菌纤维素[16-17]。在静态表面发酵过程中，由醋酸菌产生的多糖菌膜使细胞聚集并可以改善细菌适应环境的能力。此外，菌膜将醋酸菌漂浮在发酵液表面，为醋酸菌提供呼吸空间，促进乙酸发酵过程。随着时间的推移，在醋酸菌细胞周围产生过量的纤维素，这将阻碍醋酸菌与空气和发酵液之间的物质交换。搅拌频率过高，会持续对菌膜进行破坏；搅拌频率过低，则产生的细菌纤维素会对醋酸菌产生消极 作用[18]，都会影响醋酸菌的生长。

在乙醇发酵阶段，以较高频率搅拌可以使发酵液通入适量氧气、排出二氧化碳和生化作用产生的热量，并且使物料混匀，有利于酵母菌的增殖。但乙醇发酵过快，乙醇体积分数快速升高，会对酵母产生抑制，而淀粉转化为糖却在继续进行，导致玫瑰醋残余的还原糖较高，最终得率较低；搅拌频率过快，会对醋酸菌菌膜产生持续破坏，并且乙醇体积分数过高也会对醋酸菌产生抑制，导致醋的酸度很难上升，容易引起醋的腐败。搅拌频率最低，酵母菌的增殖速度最慢，乙醇发酵速度较慢，以至于在有较多还原糖剩余时，由于酸度上升酵母菌生长受到抑制，停止了乙醇发酵，也会降低玫瑰醋最终得率。

2.2 玫瑰醋有机酸含量分析

在各组玫瑰醋发酵完成之后，利用高效液相色谱对各组玫瑰醋样品中有机酸含量进行测定。并用HCA、PCA等方法对玫瑰醋中有机酸含量进行分析，比较不同发酵罐以及搅拌频率对玫瑰醋样品中有机酸含量的影响，以传统玫瑰醋为对照。

表 3 发酵结束玫瑰醋中有机酸质量浓度Table 3 Organic acid contents of rosy vinegars produced using different fermenters with different stirring frequencies

由表3可以看出，9 种特征性有机酸在玫瑰醋样品里都有检出，用回流搅拌法生产玫瑰醋的有机酸含量低于其他组玫瑰醋样品。乙酸和乳酸在所有玫瑰醋样品中所占比例最大，占特征性总酸的90%左右。其他7 种有机酸（草酸、酒石酸、苹果酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、焦谷氨酸、丙酮酸）含量较低，这些有机酸大部分是三羧酸循环途径的中间代谢物，在生成的同时也被作为其他代谢途径的前体进入更为复杂的代谢途径，所以其在醋酸发酵过程中不会有大量积累[19]，但它们对食醋的滋味和风味起重要的作用。乙酸是食醋酸味的主要来源，主要是乙醇发酵环节的密闭发酵期或醋酸发酵环节后期的米醋发酵醪中的乳酸杆菌和链球菌作用而生成，除此之外，有些种类的乳酸菌能将丙酮酸作为受氢体而生成乳酸[20]。单纯的醋酸刺激性很大，回味短。非挥发性酸含量提高对丰富醋的风味有重要意义，苹果酸酸味圆润持久，琥珀酸有鲜味，苹果酸、柠檬酸、琥珀酸能缓冲乙酸的刺激性，可以提高食醋的酸味平和性[21-24]。

图 3 发酵结束玫瑰醋中非挥发酸含量Fig. 3 Non-volatile acid contents of rosy vinegars produced using different fermenters with different stirring frequencies

由图3可以看出，各醋样的非挥发性酸含量差异比较显著。用机械搅拌法生产的玫瑰醋的非挥发性酸含量显著高于其他醋样，这是由于机械搅拌对发酵液搅拌比较剧烈，对物料破碎比较充分，可以增加发酵液中的溶氧量，有利于微生物的繁殖代谢，因此可以积累大量代谢产物，非挥发性有机酸大量积累。3-3醋样中的非挥发性酸质量浓度最高，高达25.59 g/L，说明用机械搅拌法生产玫瑰醋有助于非挥发性酸的积累。用回流搅拌法生产的玫瑰醋的乳酸含量显著高于其他醋样。气动搅拌法生产的玫瑰醋的非挥发酸含量与传统方法生产的玫瑰醋非挥发酸含量相当。由图4可以看出3 种发酵罐的搅拌效果，利用发酵罐以及传统手工对发酵液进行搅拌后，发酵液中溶氧量以及发酵罐氧气体积分数均会大幅上升，但搅拌后，两者均会快速下降，在120 min后维持动态平衡。说明搅拌对发酵提供的氧气很有限，基本可以忽略，因此搅拌频率对玫瑰醋中的有机酸影响较小。这与浙江玫瑰醋是静态表面发酵的情况相符。回流搅拌发酵罐在搅拌后发酵罐氧气含量显著低于其他组，发酵液温度显著高于其他组，这是由于回流搅拌发酵罐口径较小，不利于气体交换和散热。而低氧气浓度和高温都有利于乳酸菌的生长，因此回流搅拌发酵罐中的乳酸含量显著高于其他组。气动搅拌发酵罐的形状与传统缸一致，因此搅拌后发酵液中的溶氧量、发酵罐内其他氧气含量、发酵液温度无显著差异，两者有机酸含量较相似。

图 4 3 种发酵罐搅拌效果图Fig. 4 Changes in the amount of oxygen dissolved in fermentation broth, oxygen concentration in fermenters and fermentation broth temperature after stirring

图 5 发酵结束玫瑰醋中有机酸HCA（A）和PCA（B）结果Fig. 5 HCA (A) and PCA (B) plots of organic acid contents in rosy vinegars produced using different fermenters

由图5可以看出，不同发酵罐发酵对玫瑰醋中有机酸含量影响较大。HCA将醋样分为4 大类，由PCA结果可以看出，回流法发酵罐发酵的玫瑰醋乳酸含量比较突出，气动搅拌发酵罐和传统方法生产的玫瑰醋呈味有机酸为琥珀酸，机械搅拌发酵罐生产的玫瑰醋呈味有机酸主要为α-酮戊二酸、丙酮酸、苹果酸，以上结果说明搅拌方法对玫瑰醋中的有机酸含量影响较大，搅拌频率对有机酸含量基本无影响。

2.3 玫瑰醋中挥发性成分分析

玫瑰醋香气是衡量其品质的一个重要指标，实验用气相色谱-质谱对各组玫瑰醋样品中的挥发性成分进行分析，采用计算机检索谱库，由Xcalibur软件系统完成，未知化合物通过计算机检索与NISTDEMO2.0谱库相匹配，对正反匹配度都大于800（最大值为1 000）的鉴定结果给予定性，结合化学成分的保留时间、质谱图谱、实际成分和保留指数等鉴定化合物结构，从而确定浙江玫瑰醋的香气组成成分。

用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱对机械化生产醋样的挥发性成分进行测定，以传统酿造玫瑰醋作对照，共检测出67 种挥发性成分，结果见表4。其中醇类物质10 种、酸类物质10 种、酯类物质29 种、醛类物质4 种、酚类物质6 种、酮类物质6 种。各类挥发性成分含量见 图6（由于乙酸已经用高效液相色谱精确测出，因此这里不对乙酸进行讨论）。

表 4 玫瑰醋发酵结束发酵罐中挥发性成分质量浓度Table 4 Volatile composition of rosy vinegars produced using different fermenters mg/L

续表4

在所有玫瑰醋样品中，含量较高的醇类物质为乙醇、苯乙醇、3-甲基正丁醇。采用机械搅拌法生产的玫瑰醋其醇类物质含量要高于其他组。这些醇是醋中风味的重要贡献者[25]。苯乙醇是苯丙氨酸在酵母作用下经Strecker降解产生醛后进一步还原生成[26]，这种化合物目前被鉴定为酒中主要的芳香族化合物[27]。苯乙醇在玫瑰醋样品中含量很高，占醇类物质总含量的60.00%左右，苯乙醇具有清甜的玫瑰花香可以赋予玫瑰醋良好的香味。

图 6 发酵结束玫瑰醋中挥发性成分含量Fig. 6 Contents of various classes of volatile components in rosy vinegars produced using different fermenters

在玫瑰醋样品中检出含量较高的酸类物质（除乙酸）为3-甲基丁酸、辛酸、癸酸。但在回流法酿造的玫瑰醋中未检出3-甲基丁酸和癸酸。3-甲基丁酸是以支链氨基酸L-亮氨酸为前体经微生物降解生成。3-甲基丁酸被认为是酵母蛋白质代谢的副产物。3-甲基丁酸是牛奶香气、酸味香气、水果香气和脂肪香气的组合。可以赋予玫瑰醋良好风味[28]。

酯类物质在玫瑰醋中含量很高，玫瑰醋中主要的酯类物质为乙酸乙酯、2-苯乙酸乙酯、乙酸异戊酯。机械搅拌法生产的玫瑰醋乙酸乙酯含量显著高于其他各组样品。用回流搅拌法生产的玫瑰醋酯类物质含量显著低于其他组。用气动搅拌法生产的玫瑰醋其酯类物质含量与传统方法生产玫瑰醋相当。酯类化合物的形成途径主要有两条：一是在酯酶的催化下由酸类化合物和相应的醇类化合物缩合而成；二是乙酰辅酶A在醇酰基转移酶的作用下和相应的醇类化合物缩合形成。酯类物质大多具有花香和果香味，可以赋予玫瑰醋良好的香味[29-30]。

玫瑰醋中检测出的醛类、酚类和酮类物质的种类很少。各组玫瑰醋醛类和酚类物质含量相当。但用气动搅拌法生产的玫瑰醋的酮类物质显著低于其他各组。玫瑰醋中醛类物质含量最高的是苯甲醛，其具有甜味、果味、坚果和焦糖气味，可以赋予醋样品良好的香气。由图6可以看出，酚类物质含量是所有香气成分中最低的，但由于它们的气味阈值低，它们的味道是食醋特有的香气[31-33]。

回流搅拌发酵罐的气体交换和散热效果比其他发酵罐差（图4），发酵过程出现异常，因此用回流搅拌发酵罐生产的玫瑰醋酯类、酸类、醛类挥发性成分显著低于其他玫瑰醋样品，品质较差。机械搅拌发酵罐搅拌强度很大，对物料搅拌较为充分，有利于发酵液中的生化反应，生产的玫瑰醋中酯类物质含量显著高于其他玫瑰醋样品，酯类物质具有花香和果香味，可以赋予玫瑰醋良好的香气。气动搅拌发酵罐形状及搅拌效果与传统手工酿造相似，因此其挥发性成分的组成与传统玫瑰醋相似，其品质与传统玫瑰醋接近。

图 7 发酵结束玫瑰醋中挥发性成分含量HCA（A）和PCA（B）结果Fig. 7 HCA (A) and PCA (B) plots of volatile components of rosy vinegars produced using different fermenters

对各醋样的挥发性成分（包括挥发性有机酸）含量进行HCA和PCA[34-36]，结果见图7。可以看出，搅拌频率对玫瑰醋挥发性成分含量影响不大，但搅拌方法对挥发性成分的影响较大。HCA将玫瑰醋样品分为3大类：Group 1：以不同频率搅拌的回流搅拌法生产的玫瑰醋；Group 2：以不同频率搅拌的机械搅拌法生产的玫瑰醋；Group 3：以不同频率搅拌的气动搅拌法生产的玫瑰醋和传统方法生产的玫瑰醋。回流搅拌法生产的玫瑰醋与机械搅拌、气动搅拌和传统玫瑰醋有较大差异。传统方法生产的玫瑰醋与气动搅拌生产的玫瑰醋聚为一类，说明气动搅拌法酿造的玫瑰醋与传统方法酿造的玫瑰醋的挥发性成分构成比较接近。其中2-2与传统方法酿造的玫瑰醋单独聚为一个小类，说明用气动搅拌并且搅拌频率为5 d 1 次生产的玫瑰醋的挥发性成分构成与传统方法酿造的玫瑰醋最接近。

由图7B可以看出，各类玫瑰醋的呈味物质有所差异，由回流搅拌法生产的玫瑰醋分布很集中，处于第4象限。传统方法生产的玫瑰醋与气动搅拌法生产的玫瑰醋比较靠近可以分为一类，说明以气动搅拌法对玫瑰醋进行搅拌时，其搅拌强度和搅拌后的溶氧量与传统方法对玫瑰醋进行搅拌相似。PCA的结果与HCA结果一致。由图7可以看出，Group 1的呈味物质主要有辛酸、苯乙酸乙酯、2-乙基丁酸乙酯、十二烷酸、2-苯乙酸乙酯等；Group 2的呈味物质主要有辛酸乙酯、壬酸乙酯、丁二酸二乙酯、2-甲基丙酸乙酯等；Group 3的呈味物质主要有糠醛、癸酸乙酯、己酸乙酯、苯甲醛等。

2.4 感官评定

图 8 发酵结束的玫瑰醋感官评定结果Fig. 8 Sensory evaluation of rosy vinegars produced using different fermenters

由图8可以看出，由气动搅拌发酵罐生产的浙江玫瑰醋与传统玫瑰醋感官比较相近。各感官指标在达到最佳时得分最高，因此各组玫瑰醋在雷达图上围成的面积可以定量评价醋样的感官得分，分别为：1-1：204.34；1-2：226.25；1-3：209.89；2-1：230.71；2-2：270.28；2-3：214.89；3-1：208.87；3-2：240.28；3-3：215.39；传统：256.12。由于气动搅拌发酵罐的形状与搅拌效果与传统玫瑰醋相似，气动搅拌发酵罐生产的玫瑰醋在有机酸、挥发性成分组成与传统玫瑰醋最接近，因此其感官评定结果也与传统玫瑰醋接近。回流搅拌发酵罐由于设计的不合理性，导致散热和气体交换受阻，因此玫瑰醋的感官评定结果较差。由结果可以看出，只有2-2玫瑰醋的感官得分高于传统玫瑰醋。因此用气动搅拌发酵罐，并且搅拌频率为5 d 1 次的生产方式可以生产较高质量的玫瑰醋。

3 结 论

用气动搅拌发酵罐和机械搅拌发酵罐，搅拌频率为5 d 1 次的酿造方式，可以将浙江玫瑰醋得率从传统的7.84 kg分别提高到8.25 kg和8.13 kg；用回流搅拌发酵罐生产的玫瑰醋乳酸含量较高，机械搅拌发酵罐可以提高玫瑰醋中非挥发有机酸酸含量，对有机酸含量进行PCA和HCA，发现不同发酵罐对浙江玫瑰醋有机酸组成有较大影响，搅拌频率对有机酸影响不大；随着搅拌频率的增加可以增加玫瑰醋中氨基酸含量；用回流搅拌发酵罐生产的浙江玫瑰醋挥发性成分显著低于其他玫瑰醋，对挥发性成分含量进行PCA和HCA，发现不同发酵罐对玫瑰醋中挥发性成分影响较大，搅拌频率影响较小。采用气动搅拌发酵罐并且搅拌频率为5 d 1 次的生产方式生产的玫瑰醋与传统玫瑰醋品质最接近。本研究为浙江玫瑰醋实现机械化生产提供了理论支持。