一株绿藻Chlamydomonassp.PD-4产油性能的初步评价

摘要 [目的]评价绿藻Chlamydomonas sp.PD-4能否作为油藻的备选藻株。[方法]研究该藻基本的生化组成以及不同培养条件下该藻的生长、油脂含量以及脂肪酸组成，并且观察该藻的气浮现象。[结果]该藻在100 μmol/（m2·s）培养9 d可产25.81%蛋白、18.82%油脂以及23.50%糖。该藻在200 μmol/（m2·s）的光以及氮浓度限制条件下培養，其油脂含量和多不饱和脂肪酸含量都会进一步提高。在较高的光强下静置培养，该藻可以自身气浮。[结论]该藻具有产油微藻的潜力。

关键词 Chlamydomonas sp.PD-4;生化组成;油脂含量;脂肪酸组成

中图分类号 Q949.93 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）03-0058-03

Abstract [Objective]The research aimed to evaluate the possibility as a candidate for biodiesel production of a green algae Chlamydomonas sp.PD4. [Method]The basic biochemical composition， the capability in the growth， the lipid accumulation and the carbon chain composition of main fatty acid of Chlamydomonas sp.PD4 were studied，the flotation of Chlamydomonas sp.PD4 was also studied.[Result]The algae accumulated 25.81% protein，18.82% total lipid and 23.50% carbonhydrate after 9 d cultured in 100 μmol/（m2·s） radiation. The algae were cultured under the conditions of light of 200 μmol/（m2·s） and nitrogen concentration， and the oil content and polyunsaturated fatty acid content were further improved.The algae was cultured in a resting place at higher light intensity， and the algae could float on its own.[Conclusion]The algae is a valuable and useful oleaginous algae.

Key words Chlamydomonas sp.PD4;Biochemical composition;Lipid content;Fatty acid composition

微藻能源是最具有发展潜力的生物能源之一[1]。目前大规模培养微藻生产油脂仍存在2个重要的限制因素：一个是微藻油脂的产率相对较低，另一个是微藻生产和采收成本较高[2]。提高藻种生物量和油脂产量，或用产高附加值产物的藻株生产生物柴油，选择便于采收的藻株，是降低微藻油成本较为理想的途径。该研究探讨了一株筛选自青岛平度泽河中的衣藻。该藻在采样水体中处于优势地位且易于气浮分布于水体表面。通过对该藻生长、产油性状以及自气浮特性的观察初步判断该藻是否具有产油藻的潜力，为后续研究类似藻株（自身气浮）作为产油藻株提供一定的借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料的获取

在平度泽河与秀水河交汇处取样。将部分水样离心、用灭菌蒸馏水洗涤、稀释后通过平板分离获得纯种藻株PD-4。

1.2 藻株的分子生物学鉴定

取20 mL培养的藻细胞5 000 r/min离心5 min，收集藻细胞。将藻细胞于液氮中研磨后转入1.5 mL离心管。使用TIANGEN植物总DNA试剂盒（TIANGEN）提取基因组DNA，操作方法按照试剂盒说明书进行。

DNA经PCR扩增，回收试剂盒（OMEGA）纯化，连接至pMD18-T质粒载体（TaKaR）上，转化后筛选阳性菌落到上海桑尼生物技术有限公司测序。向NCBI提交测序结果，搜索同源序列。

1.3 该藻基本生化组成的测定

将处于对数期的藻接种在柱状光生物反应器中（3 cm×30 cm，玻璃材质），通气、全光照培养，通气量为0.2 V/V·min，CO2含量为1%。光照强度为100 μmol/（m2·s），培养温度为（25±1）℃。

培养9 d后，将藻样离心（Beckman离心机，美国Beckman公司）、蒸馏水清洗3次，冻干（低温冷冻干燥机，北京博医康）。

蛋白质含量的测定通过Vario EL元素分析仪（德国Elemtnar公司）测定N的含量（%），蛋白含量为 N×6.25[3]。

总糖按照蒽酮比色法测定[4]。

总脂测定见文献[5]。

1.4 该藻在不同培养条件下的产油性状

将处于对数期的藻种接种在柱状光生物反应器，通气、全光照培养，初始接种量为0.15 g/L，通气量为0.2 V/V·min，CO2含量为1%，培养基为BG11，其中一组NaNO3浓度有所改变。详见表1。

1.5 该藻气浮现象的观察

取一定量的藻细胞，接种于含150 mL BG11培养基的250 mL三角瓶中，于200 μmol/（m2·s）光强处静置培养，观察该藻能否悬浮分层。

另外，将三角瓶中自气浮的藻（上层）和沉淀到容器底部的藻（下层）分别收集，用透射电镜对上下层藻细胞进行结构观察。电镜样品制作方法见文献[6]。

2 结果与分析

2.1 藻株鉴定

经Blast检索，结合细胞形态，判断试验藻株PD-4为Chlamydomonas sp.。向NCBI提交18sDNA碱基序列后，该藻株序列获得的登录号为JQ247307。

2.2 該藻基本生化组成

该藻经全光照培养9 d，其体内的蛋白质含量最高，为25.81%±0.69%，其次是总糖，为2350%±1.15%，油脂最低，为18.82%±0.73%。仅从蛋白、油脂、多糖含量来讲，这株藻稍显平庸。

2.3 该藻产油性状分析

从绿藻Chlamydomonas sp.PD-4在不同条件下的产油性状（表2）可以看出，经过9 d的培养，Chlamydomonas sp.PD-4油脂含量为18.63%～26.19%，油脂产率为68～116 mg/（L·d）。与一些公认的含油量和油脂产率较高的藻株（表3）相比，其油脂含量和产率并不低，表明该藻株具有作为产油微藻的潜力。

2931%、11.08%、5.14%，另有6.14%的未定性脂肪酸。脂肪酸主要是由C16和C18组成，这与柴油分子15个左右的碳链极其相似[8]。该藻油脂含有较高含量的油酸（C18∶1）。较高含量的油酸增强了生物柴油长期储存的氧化稳定性[9]，降低了其在寒冷地区使用时的冷滤点（CFPP）[10]。因此，Chlamydomonas sp.PD-4抽提的油脂适用于高品质的生物柴油的生产。

2.4 该藻自气浮现象

该藻在较高的光强（200 μmol/（m2·s））下静止培养3 d就可以观察到该藻在液面处漂浮了一层，到了第12天，藻体基本都悬浮到水体的上层。透射电镜的结果显示（图1），上层细胞和下层细胞的结构有明显的区别。下层细胞具有荚膜，细胞内有较多的淀粉粒;上层细胞基本没有荚膜结构，含有较多的油滴。细胞构成的变化可能是这些藻悬浮的重要原因，而该藻在特定阶段易于悬浮的特性便于采收。

在敞开的玻璃容器中培养该藻同样观察到自气浮现象，并且没有观察到杂藻污染;在河道采集地某些静水区域该藻长期占据绝对优势并在水体上层形成厚厚的一层。在规模培养中，藻易受捕食者和病原体的侵扰，形成杂藻、原生动物等污染，导致群落更替或被原生动物取代等[11]。该藻在野外能够长期占据优势，表明该藻对环境适应性强，对病虫害的抵抗力强，这个特点也使其比较适合大规模培养。

3 结论与讨论

该试验研究了绿藻Chlamydomonas sp. PD-4基本的生化组成以及不同培养条件下该藻的生长、油脂含量以及脂肪酸组成，并且观察了该藻的气浮现象。结果表明，该藻在100 μmol/（m2·s）培养9 d可产25.81%蛋白、18.82%油脂以及23.50%糖;该藻在200 μmol/（m2·s）的光以及氮浓度限制条件下培养，其油脂含量和多不饱和脂肪酸含量都会进一步提高;在较高的光强下静置培养，该藻可以自身气浮。这表明该藻具有产油微藻的潜力。

Chlamydomonas sp. PD-4因其它生长快、油脂含量较高、采收方便、对污染抵抗力强等特点具有一定的培养价值，也具有一定的潜力来做进一步的研究。现有筛选产油藻株时，通常只关注了生长速度、含油量这2个最核心的相关参数，对于藻的其余性状则关注不多。通过该研究可知气浮于液体表层的藻不仅含有较高的油脂含量（油滴较多），而且该性状便于藻类收集，在一定程度上可能用于产油藻的筛选。

参考文献

[1] 刘天中，王俊峰，陈林.能源微藻及其生物炼制的现状与趋势[J].生物产业技术，2015（4）：31-39.

[2] 左正三，孙小曼，任路静，等.微藻生产油脂培养新技术[J].中国生物工程杂志，2018，38（7）：102-109.

[3] 夏建荣，高坤山.球形念珠藻的生化组成分析[J].武汉植物学研究，2002，20（3）：223-224.

[4] 李合生，孙群，赵世杰，等.植物生理生化实验原理和技术[M].北京：高等教育出版社，2000.

[5] 邱昱晶，彭小伟，张维，等.三种不同来源的三角褐指藻的生长与油脂积累差异[J].安徽农业科学，2011，39（24）：14761-14763.

[6] 陈闽，陈晓琳，刘天中，等.不同亚临界溶剂从微拟球藻湿藻中提取油脂[J].过程工程学报，2011，11（3）：380-385.

[7] GONG Y M，JIANG M L.Biodiesel production with microalgae as feedstock：From strains to biodiesel[J].Biotechnology letters，2011，33（7）： 1269-1284.

[8] 刘永定，范晓，胡征宇.中国藻类学研究[M].武汉：武汉出版社，2001：254-261.

[9] KNOTHE G.Dependence of biodiesel fuel properties on the structure of fatty acid alkyl esters[J].Fuel Process Technol，2005，86（10）：1059-1070.

[10] STOURNAS S，LOIS E，SERDARI A.Effects of fatty acid derivatives on the ignition quality and cold flow of diesel fuel[J].J Am Oil Chem Soc，1995，72（4）：433-437.

[11] WANG H，ZHANG W，CHEN L，et al.The contamination and control of biological pollutants in mass cultivation of microalgae[J].Bioresour Technol，2013，128：745-750.