割罐法发酵聚苹果酸的工艺优化

(农业农村部环境保护科研监测所,天津 300191)

聚苹果酸(Polymalic acid,PMLA)是聚酯类聚合物,是一种新的天然的生物多聚物,不同于其他天然多聚物,聚苹果酸分子中有许多自由羧基,这些自由羧基使它具有了许多特别的性质,如水溶性[1]、易修饰性[2]、易代谢性[3]和可降解性[4]等。由于它具有这些特性,人们正在尝试用聚苹果酸制造药物载体(Drug delibery system)或作为原生药物(Pro-drug),将来还可发展用在生物医学材料[5]、包装材料、微胶囊材料、吸水物质、化妆品以及作为某些微生物DNA聚合酶的抑制剂等,应用范围很广,并具有很大的市场潜力[6-9]。聚苹果酸有三种结构分别为α、β、γ型[10],如图1所示。目前在自然界生物体内发现的天然的聚苹果酸主要是β-聚苹果酸,它具有良好的生物相容性,也是当今的热点研究问题[11-13]。目前,国内外主要是以化学合成法制备聚苹果酸为主,因其分子量小在应用方面受到限制,生物合成制备β-聚苹果酸成为现今研究的热点[14]。由于聚苹果酸带有一个羧基侧链,可以通过化学改性和其他手段得到带有特殊作用的衍生物,因此被广泛应用于生物医药等领域[15-16]。

图1 聚苹果酸的结构Fig.1 Structure of PLMA

聚苹果酸最初是1969年由Shimada等人从环状青霉(Penicilliumcyclopium)中分离得到[17]。之后,先后从PHysarumpolycepHalum、Aureobasidumsp.中发现并提取出聚苹果酸。有相关文章阐明了聚苹果酸在出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)[18]和多头绒泡菌(PHysarumpolycepHalum)[19]中的合成途径和调节机制。Holler等[20]通过追踪13C的方法阐明了聚苹果酸在多头绒泡菌细胞内的合成途径。刘双江等[16]提出,出芽短梗霉合成聚苹果酸的途径与多头绒泡菌相似。在两种真菌中,三氟乙酸会抑制聚苹果酸的合成,而琥珀酸和苹果酸,可以解除三氟乙酸的抑制作用;此外,丙二酸(琥珀酸脱氢酶的抑制剂)可以诱导开启乙醛酸支路,以作为聚苹果酸合成的替代途径[21]。

在发酵过程优化方面,中国科学院过程工程研究所的万印华等公开了利用A.pullulansipe-1发酵生产聚苹果酸的新工艺[22],使用有机氮和无机氮复合培养基,并在发酵过程中控制溶氧和pH,于7 L发酵罐中发酵4 d,得到β-聚苹果酸浓度为35.2 g/L的发酵液。该研究组还研究了A.pullulansipe-1合成聚苹果酸和菌体生长的关系。他们认为对数生长期晚期菌体的生长和聚苹果酸的合成无关,高浓度的聚苹果酸和培养基中较低的还原力抑制了菌体的生长。重复分批发酵(Repeated-batch fermetation)和细胞再循环发酵(Cell-recycle fermetation)或在两种发酵过程中维持培养基氧化还原电位(ORP)低于70 mV,均能提高聚苹果酸的产率。控制ORP的重复分批发酵中,聚苹果酸的产量和细胞的生长分别提高了21.2%和11.7%;控制ORP的细胞在循环发酵中,每单位葡萄糖合成聚苹果酸的产量提高了33.2%。

从二十世纪六十年代开始,就有人开始聚苹果酸的研究了,国外已经实现了聚苹果酸的产业化,而国内还没有可以规模生产的厂家,特别是微生物发酵聚苹果酸的产量不高[23]。本文旨在研究出芽短梗霉生物合成聚苹果酸的工艺条件,拟对影响聚苹果酸产量的因素,如培养基成分、发酵工艺条件、后提取方法等进行研究,获得优化的聚苹果酸发酵生产工艺条件,为放大发酵试验提供依据。在提纯方面也做了一定工作,提高了菌株产量,降低生产成本,简化生产工序,为大规模生产聚苹果酸奠定基础,使聚苹果酸在不久的将来能广泛应用于我国各行业。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本试验采用的是实验室诱变菌株出芽短梗霉CV26作为出发菌株；无水葡萄糖、硫酸镁(MgSO4·7H2O)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、玉米浆粉、丁二酸铵、丁二酸、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、碳酸钙(CaCO3)、氢氧化钠(NaOH)、氯化钠(NaCl)、曲拉通、无水甲醇、无水乙醇、琼脂等，均为分析纯,天津市化学试剂三厂;丙酮 分析纯,天津市北方天医化学试剂厂。

SW-CJ-1FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;ZWY-1102恒温摇床 上海智诚仪器制品有限公司;SPX-250B-Z型生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;DF-100A分析天平 唐山光电仪器有限公司;JA12002型电子天平 上海精密科学仪器有限公司;LD5-2A离心机 北京医用离心机厂;pHSJ-4A型试验pH计 上海科学仪器有限公司;CX21FS1生物显微镜 日本OLYMPUS会社;LS-B50L压力蒸汽灭菌锅 上海医用核子仪器厂;SBA-40C生物传感分析仪 山东省科学院生物研究所;BIOF-2000 5L自控发酵罐 上海高机实业有限公司;Dionex UltiMate 3000安捷伦高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 种子培养液的制备 斜面培养基:PDA培养基,200 g/L土豆,20 g/L葡萄糖,20 g/L琼脂,pH5.6。

液体种子培养基:80 g/L葡萄糖,4 g/L KH2PO4,3 g/L丁二酸铵,1 g/L丁二酸,1 g/L MgSO4·7H2O,0.07 g/L ZnSO4·7H2O,3 g/L玉米浆粉,30 g/L CaCO3(单独灭菌),调节pH至5.0,1×105Pa灭菌15 min。250 mL三角瓶装培养基50 mL。

于斜面上取一环菌种到摇瓶种子培养基中,25 ℃、180 r/min摇床培养24 h,得到种子培养液。

1.2.2 发酵培养条件 发酵培养基:120 g/L葡萄糖,3 g/L丁二酸铵,2 g/L丁二酸,1 g/L MgSO4·7H2O,0.05 g/L ZnSO4·7H2O,4 g/L玉米浆粉;30 g/L CaCO3(单独灭菌),调节pH至6.0,1×105Pa灭菌15 min。250 mL三角瓶装培养液50 mL,或5 L发酵罐培养液3 L。

将种子培养液按8%的接种量接入发酵培养基中,25 ℃培养48～72 h结束。

1.2.3 种子培养基正交试验 根据种子培养基的各成分及添加量的单因素预试验,设计9因素4水平的正交试验,按照1.2.1和1.2.2的条件,将不同种子培养基培养的种子培养液,以相同的接种量接入相同的发酵培养基中,进行聚苹果酸摇瓶发酵试验,以聚苹果酸的产量为评价指标,考察最佳的种子培养条件,如表1所示。

表1 L32(49)正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels table of L32(49)orthogonal experiment

1.2.4 发酵生长曲线 将1.2.1中的种子培养液按照8%的比例接入13瓶装有50 mL液体发酵培养基的250 mL三角瓶中,并标号0#～12#,每隔2 h取出一瓶培养液,比浊法测其细胞浓度[24]。取出1 mL菌液,5000 r/min离心5 min,弃去上清液,加入4 mL或5 mL蒸馏水使细胞重新悬浮,以蒸馏水为空白,测其在620 nm的OD值。以培养时间为横坐标,OD值为纵坐标,绘制生长曲线[25]。

1.2.5 曲拉通添加浓度对聚苹果酸发酵的影响 按照方法1.2.1和1.2.2,进行聚苹果酸摇瓶发酵试验。发酵24 h后分别添加不同体积的0.05 mol/L曲拉通母液,使各发酵培养基中曲拉通浓度为0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L,在整个发酵过程进行到72 h后,测其聚苹果酸产量和葡萄糖含量。

1.2.6 曲拉通添加时间对聚苹果酸发酵的影响 按照方法1.2.1和1.2.2,进行聚苹果酸摇瓶发酵试验。分别在发酵进行到0、6、12、18、24、30、36 h时,添加0.4 mmol/L的曲拉通,72 h发酵结束后,测其聚苹果酸产量和葡萄糖含量。

1.2.7 5 L发酵罐的转速对聚苹果酸发酵的影响 5 L发酵罐的装液量为3 L,通气量为5 L/min,pH4.5,温度25 ℃,转速分别为400、450、500、550、600 r/min,在发酵进行到24 h时加入24 mL 0.05 mol/L的曲拉通母液,以葡萄糖含量不再下降为发酵终点,测其聚苹果酸产量和葡萄糖含量,并记录发酵结束时间。

1.2.8 5 L发酵罐的通气量对聚苹果酸发酵的影响 在确定转速为500 r/min的前提下,通气量分别设定在3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 L/min,pH4.5,温度25 ℃,在发酵进行到24 h时加入24 mL 0.05 mol/L的曲拉通母液,同样以葡萄糖含量不再下降为发酵终点,测其聚苹果酸产量和葡萄糖含量,并记录发酵结束时间。

1.2.9 5 L发酵罐的pH对聚苹果酸发酵的影响 按照气量为5 L/min、转速为500 r/min的条件,将温度控制在25 ℃进行发酵试验,在发酵24 h后,加入24 mL 0.05 mol/L的曲拉通母液,同时连动5%的NaOH补料瓶和5%的硫酸补料瓶,自动控制pH在3.5、4、4.5、5,并从24 h开始每隔10 h取样测聚苹果酸产量,发酵共进行84 h。

1.2.10 割罐法发酵的试验方法 按照通气量为5 L/min、转速为500 r/min、pH4.5的条件,将温度控制在25 ℃进行发酵试验,在发酵进行到24 h时加入24 mL 0.05 mol/L的曲拉通母液。当发酵液中葡萄糖含量低于10 g/L的时候,将发酵液排出2 L,再将2 L灭过菌的发酵培养基补入发酵罐中继续发酵70 h,补料后每间隔10 h测量一次聚苹果酸产量和葡萄糖含量。其中补入的发酵培养基中,碳氮源的浓度分别取初始发酵培养基的40%、60%、80%和100%。

1.2.11 不同有机溶剂对聚苹果酸提取效果的影响 发酵液絮凝方法:将100 mL浓度为5%的聚氯化铝溶液加入1000 mL发酵液中,搅拌均匀,用10% NaOH将pH调至7.0,6000 r/min离心5 min取上清液待测。

10 mL同一批次絮凝后离心的发酵液于100 mL烧杯中,分别加入40 mL甲醇、乙醇、丙酮搅拌后放入4 ℃冰箱静置2 h,倒掉上清液将沉淀溶于10 mL水中测其聚苹果酸含量。

1.2.12 去除副产物普鲁兰的试验方法 取100 mL同一批次絮凝离心后的发酵液6份,测出其中普鲁兰多糖的含量,分别添加2、6、10、14、18、22 mL的甲醇,测其析出的沉淀中普鲁兰和聚苹果酸的含量。

1.3 指标测定

1.3.1 葡萄糖产量测定 将絮凝离心后的发酵液,稀释100倍,用生物传感分析仪直接测定。此方法简单快捷,偏于抓住最佳补料时机。

1.3.2 普鲁兰含量的测定 1 mL待测液体3000 r/min离心2 min,取上清液0.15 mL并加入一定体积的甲醇,混匀、离心(1300 r/min,5 min),70 ℃蒸发掉残余甲醇,加入0.15 mL水溶解沉淀物,转移到装有2 mL、0.11 mol/L乙酸钠缓冲液(pH4.5)的试管中,加入1 mL淀粉葡萄糖苷酶和普鲁兰酶混合液(活力分别为2515和415 U/mL),37 ℃水解过夜。用高效液相色谱测定葡萄糖含量。选用氨基酸柱(4.6 mm×250 mm),示差折光检测器,流动相为乙腈和水(体积比75∶25),流速为1.0 mL/min,柱温40 ℃[26]。用同样方法处理普鲁兰标准品(Sigma,USA)做参照物。此方法比生物传感分析仪测量的更精确。

1.3.3 聚苹果酸含量的检测 将絮凝离心后的发酵液,用高效液相色谱法,选用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,4 μm),流动相为乙腈和0.025 mol/L的KH2PO4混合溶液(用磷酸调pH至2.5)(体积比=5∶9),流速为1.0 mL/min,检测波长为210 nm,柱温为25 ℃[27-28]。用同样方法处理聚苹果酸标准品(Sigma,USA)做参照物。

1.4 数据分析

用正交设计助手II V3.1专业版对正交试验结果进行极差分析和方差分析,用SPSS 21.0软件对试验数据进行差异显著性分析,采用单因素方差分析中的Duncan’s检验,差异显著性水平设为P=0.05。每个试验三次平行,结果图表用Microsoft Excel绘制,数据显示为平均值±标准偏差。

表2 正交试验设计与结果Table 2 Design and results of orthogonal experiment

2 结果与讨论

2.1 种子培养的正交试验结果

按照1.2.3中表1设计的正交试验进行摇瓶验证试验,得到的最后结果,见表2、表3。

由表2可知,通过极差分析得到,种子培养条件的主次因素顺序依次为:玉米浆粉>磷酸二氢钾>丁二酸铵>碳酸钙>转速>葡萄糖>丁二酸>硫酸锌>硫酸镁,由表3可知,玉米浆粉、磷酸氢二钾、丁二酸铵的添加量对试验结果有显著性影响。因此得到的最佳组合为A4B1C3D3E1F3G4H3I1,正交试验表中得到聚苹果酸产量最高的25号试验组合为A3B1C3D3E1F2G4H4I2,分别按照这两组条件做对照试验,得到的结果为25号正交试验的聚苹果酸产量为52.7 g/L,极差分析得到的最佳组合聚苹果酸产量为49.29 g/L,因此选择25号试验的组合为最终的种子培养条件。

表3 正交结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

由表3可知,玉米浆粉、磷酸氢二钾、丁二酸铵的添加量对聚苹果酸产量有显著性影响,主次顺序为玉米浆粉>磷酸氢二钾>丁二酸铵,其余因素对聚苹果酸产量的影响均未到达显著程度。

2.2 发酵生长曲线

按照方法1.2.4绘制发酵生长曲线,结果见图2。

图2 发酵生长曲线Fig.2 Fermentation growth curve

由图2可知,发酵2 h,菌株进入对数生长期;发酵24～34 h,菌体生长速度减慢进入内源呼吸阶段。

2.3 加入不同浓度曲拉通后聚苹果酸的产量

曲拉通是一种表面活性剂,它可以有效的提高发酵液里的溶氧,增加细胞的通透性,使胞内产生的聚苹果酸可以迅速的输送到细胞外,从而提高菌株的生产效率,缩短发酵时间。但是曲拉通有一定的毒性,添加少了达不到效果,添加多了会使菌株中毒,影响发酵产量[29]。根据2.3的试验结果,为了减小曲拉通对菌体生物量的影响,先选择在发酵24 h后加入适量浓度的曲拉通,以研究发酵过程中添加不同浓度的曲拉通对聚苹果酸生成量的影响。确定最适添加量后,再以固定的添加量进行添加曲拉通的最佳时机的试验。按照方法1.2.5,进行聚苹果酸摇瓶发酵试验,其结果如图3所示。

图3 曲拉通添加量对聚苹果酸产量和葡萄糖含量的影响Fig.3 Effect of Triton addition on PLMA production and glucose content注:小写字母a、b、c代表聚苹果酸含量的差异显著(P<0.05),大写字母A、B、C代表葡萄糖含量的差异显著(P<0.05)。

由图3可知,少量添加曲拉通,可以增强细胞的通透性,利于微生物将胞内产生的聚苹果酸分泌至胞外,从而提高产量。但是由于曲拉通会对微生物的生物活性带来一定的伤害,因此当曲拉通的添加量达到一定程度的时候,就会导致微生物活性下降,部分微生物死亡,从而降低聚苹果酸的产量。由图中可以看到,葡萄糖的含量与聚苹果酸的关系,聚苹果酸产量越高,则葡萄糖含量越低,这是由于微生物在良好的生长环境下,将更多的葡萄糖转化成了聚苹果酸。由本试验得知曲拉通的最适添加量为0.4 mmol/L,在此条件下的聚苹果酸产量显著(P<0.05)优于其他水平,并且此时的葡萄糖含量显著(P<0.05)低于其他水平。

2.4 曲拉通添加时机对聚苹果酸产量的影响

由2.3的试验结果得到曲拉通的最适添加量为0.4 mmol/L,按照方法1.2.6,进行聚苹果酸摇瓶发酵试验,结果如图4所示。

图4 曲拉通添加时间对聚苹果酸产量和剩余葡萄糖含量的影响Fig.4 Effect of Triton adding time on PLMA production and glucose content注:小写字母a、b、c代表聚苹果酸含量的差异显著(P<0.05),大写字母A、B、C代表葡萄糖含量的差异显著(P<0.05)。

曲拉通对于微生物具有一定的毒性,由图4可知,若添加过早会影响微生物的正常生长,葡萄糖消耗不下去,产量也不高。若添加时间过晚,则起不到提高产量的作用。而在发酵进行到24 h时添加曲拉通,参考之前2.2的生长曲线,此时微生物生长进入内源呼吸阶段,菌体生长稳定,加入的曲拉通起到表面活性剂的作用,降低了发酵液的粘度,提高了发酵液中的溶氧,并改善了细胞的通透性,使得聚苹果酸的产量最高,葡萄糖含量也最低,与其他时间添加的结果存在显著(P<0.05)差异。

2.5 5 L发酵罐的转速试验

按照方法1.2.7,进行聚苹果酸5 L发酵罐发酵试验,结果见表4。

表4 转速对发酵的影响Table 4 Effect of rotation speed on fermentation

注:上标小写字母a、b、c代表每列数据之间的差异显著(P<0.05)。 由表4可以看出,当转速为600和550 r/min,葡萄糖几乎全部耗尽,但是聚苹果酸的产量却不是最高的,且由于剪切力过高导致聚苹果酸分子量变小,发酵液粘度明显下降,菌体生长过快提前进入衰退期。而400和450 r/min由于溶氧低,不利于葡萄糖的利用。当转速为500 r/min时,聚苹果酸的产量最高,虽然相较于450和550 r/min条件下的产量,差异不显著(P>0.05),但此时发酵周期显著(P<0.05)低于450 r/min;与550 r/min条件下的发酵结果相比虽然差异不显著(P>0.05),但能耗低。因此综合能耗和产出考虑,选择500 r/min 为5 L小罐的最适转速。

2.6 5 L发酵罐的通气量试验

发酵中除转速影响溶氧外,通气量也是重要因素之一。按照方法1.2.8进行聚苹果酸通气量的发酵试验,结果见表5。

表5 通气量对发酵结果的影响Table 5 Effect of Ventilation volume on fermentation

注:上标小写字母a、b、c代表每列数据之间的差异显著(P<0.05)。

由表5可知,通气量低的微生物代谢速度慢,耗糖慢,时间长,聚苹果酸产量也低。通气量为5.0、6.0和5.5 L/min时,聚苹果酸产量和葡萄糖含量没有显著性差异(P>0.05),但是从发酵总时长来看,通气量为5.5和6.0 L/min时,发酵时间与其他水平存在显著(P<0.05)差异。因此就能耗上考虑,选择5.5 L/min的通气量最适合。

2.7 5 L小罐pH的控制

按照方法1.2.9进行发酵试验,结果如图5。

图5 发酵中控制pH对聚苹果酸产量的影响Fig.5 Effect of pH controlling on PLMA production

由图5可知,若控制发酵中的pH在4.5,聚苹果酸产量最高,发酵结束的时间最短,故选择4.5作为发酵中期最适的pH。

2.8 割罐法发酵试验

采用上述试验得到的最佳方案,按照方法1.2.10,在5 L发酵罐上进行聚苹果酸发酵试验,结果如图6所示。

图6 补料后的聚苹果酸产量和葡萄糖含量Fig.6 PLMA production and glucose content after supplementation of medium注:a:100%的碳源和氮源条件下的葡萄糖;b:80%的碳源和氮源条件下的葡萄糖;c:60%的碳源和氮源条件下的葡萄糖;d:40%的碳源和氮源条件下的葡萄糖;e:100%的碳源和氮源条件下的聚苹果酸产量;f:80%的碳源和氮源条件下的聚苹果酸产量;g:60%的碳源和氮源条件下的聚苹果酸产量;h:40%的碳源和氮源条件下的聚苹果酸产量。

由图6可知,培养基中葡萄糖含量过高,对微生物生长反而有抑制作用,导致产量不高,且剩余葡萄糖含量过高又利用不掉,造成成本的浪费;而葡萄糖量太低又不能为微生物生长产聚苹果酸提供足够的养分,从而产量不高,且当葡萄糖耗尽后,微生物会分解聚苹果酸来满足生长需求;因此综合发酵周期、聚苹果酸的产量和成本考虑,加入培养基的碳氮源为初始培养基的60%最为合适,整个发酵周期124 h,得到聚苹果酸总量318 g。

2.9 聚苹果酸的后提取

2.9.1 不同有机溶剂对聚苹果酸沉淀的影响 不同的有机溶剂对于聚苹果酸的沉淀效果不同,试验中对甲醇、乙醇、丙酮对聚苹果酸的沉淀效果进行了比较。按照方法1.2.11进行试验,结果如图7所示。

图7 不同有机溶剂的沉淀效果Fig.7 Sedimentation effect of different organic solvents注:小写字母a、b、c代表沉淀中聚苹果酸含量的差异显著(P<0.05)。

由图7可知,甲醇的醇沉效果是最好的,与其他两种溶剂存在显著性差异(P<0.05)。而且甲醇沸点低,易于回收,故选择甲醇为沉淀聚苹果酸的有机溶剂。

2.9.2 除去发酵中的副产物普鲁兰多糖 同时加入不同浓度的有机溶剂,找到最佳的比例,可以去除发酵液中的杂质普鲁兰,纯度较高的聚苹果酸。按照方法1.2.12进行试验,结果如图8所示。

图8 甲醇添加量对普鲁兰去除效果的影响Fig.8 Effect of methanol addition on the removal of pullulan注:小写字母a、b、c代表沉淀中聚苹果酸含量的差异显著(P<0.05),大写字母A、B、C代表沉淀中普鲁兰含量的差异显著(P<0.05)。

由图8可知,当甲醇的添加量为2 mL和6 mL时,虽然没有聚苹果酸析出,但是沉淀中普鲁兰的含量与其他水平相比较,存在显著性差异(P<0.05),料液中仍残留大量普鲁兰。当甲醇用量为10 mL,即与发酵液的体积比为1∶10的时候,虽然有6.76%的聚苹果酸析出,但是大部分仍存在于上清液里,而析出的普鲁兰可用玻璃棒挑出。然后再添加4倍体积的甲醇,就可以得到相对比较纯的聚苹果酸沉淀了。

3 结论

文章中首先通过正交试验,得到最佳种子培养基配方为80 g/L葡萄糖,4 g/L KH2PO4,3 g/L丁二酸铵,1 g/L丁二酸,1 g/L MgSO4·7H2O,0.07 g/L ZnSO4·7H2O,3 g/L玉米浆粉,30 g/L CaCO3(单独灭菌),转速为180 r/min。根据CV26b的发酵生长曲线,在发酵24 h的时候添加0.4 mmol/L的曲拉通,提高细胞通透性又不影响菌体生长,可提高聚苹果酸的产量。5 L发酵罐的最佳转速为500 r/min,最适通气量为5.5 L/min,24 h后加入0.4 mmol/L的曲拉通并把pH控制在4.5,当剩余葡萄糖含量低于10 g/L时,将发酵液排出2 L,再将2 L灭过菌的发酵培养基补入发酵罐中继续发酵60 h。5 L发酵罐整个发酵周期124 h,可收集到聚苹果酸的总量达到318 g。相较优化前,每升发酵液的聚苹果酸产量提高了46.8%,单一批次的发酵时间增加了40 h,产聚苹果酸总量是原来的2.25倍。这种割罐法延长了发酵周期,减少了重复上罐下罐培养种子等一系列繁琐工作,这在生产上就可以大大的降低成本。

文中还比较了甲醇、乙醇、丙酮的沉淀效果,确定4倍体积的甲醇对聚苹果酸的沉淀效果最好并且方便回收利用。同时用1/10体积的甲醇还可以去除产物中的杂质普鲁兰,得到纯度较高的聚苹果酸沉淀。

上述一系列试验的意义在于,化繁为简,提高了生物法大规模生产聚苹果酸的可能性,为将来聚苹果酸的产业化奠定了一定的基础。