TLR3基因多态性与复发性流产相关性分析

钟丽君 王永周 汪 静 唐 琳

西南医科大学附属中医医院(泸州，646000)

复发性流产(RSA)是临床常见的病理妊娠，在育龄妇女中发生率为1%～5%[1]。生殖免疫学研究认为RSA发病多与免疫因素有关[2-3]。染色体异常是已知的明确发病因素之一，Toll样受体3(TLR3)是TLR家族成员，TLR可识别病原微生物特征性分子结构，介导抗感染免疫，可能通过与多聚次黄苷酸-胞苷酸[poly(I-C)]激活NK细胞，导致胚胎吸收而诱发流产[4]。因此推测TLR基因多态性可能与RSA存在某种联系，目前缺乏相关研究。鉴于此，本研究前瞻性选择305例RSA患者，探讨TLR基因多态性与RSA的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入标准：①连续自然流产≥3次；②无子宫器质性病变，无支原体、衣原体等细菌性阴道病。排除标准夫妇双方近亲结婚。选择2015年1月-2017年1月本院妇产科收治的RSA患者305例为研究对象(RSA组)，年龄(28.1±5.6)岁(21～36岁)，体质指数(BMI)(26.2±2.0)kg/m2(21～36 kg/m2)；正常妊娠孕妇200例为对照组，年龄(28.1±5.8)岁(20～35岁)，BMI(26.9±2.5)kg/m2(20～37 kg/m2)。两组比较无差异(P>0.05)。本研究已经获得本院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2 基因检测

采集两组禁食水12h外周静脉血抗凝，48h内完成血全基因组DNA提取，应用AU1001 核酸提取仪及配套试剂( 北京百泰克公司)提取 DNA，UV7500双光束紫外可见分光光度计 (上海棱光技术有限公司) 鉴定DNA纯度和完整性，取吸光度(A260/280 nm) 值在1.5～2.0、浓度>50 ng/μl的 DNA 样品待检。 GenBank数据库查找基因TLR基因，Primer Premier 5.0软件rs5743305、rs 3775290 TLR基因设计引物并进行多态性聚合酶链反应(CR-RFLP)扩增，引物合成由上海天昊公司完成。反应条件:94℃ 预变性5min ，94℃ 变性30s, 55℃退火 30s，72℃ 延伸30s，35个循环，72℃ 延伸5min。取出扩增产物25 μl，琼脂糖凝胶电泳，FR-250 电泳仪(上海复日公司) 扫描并拍照。 采用iMLDR法，取PCR扩增物10 μl送上海天昊基因科技公司分析。

1.3 抗体检测

酶联免疫吸附试验检测ACA-IgM、ACA-IgG抗体水平，批内、批间变异系统控制在<10%，试剂盒购自德国欧蒙公司。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 rs5743305位点TLR3基因分型

两组均完成rs5743305、rs 3775290位点 TLR3基因检测，经Hardy-Weinberg检测TLR3基因遗传平衡(P>0.05)。两组rs5743305位点TLR3基因分型、等位基因占比有差异(P<0.05)，见表1。

表1 两组rs5743305位点TLR3基因分型占比[例(%)]

2.2 rs 3775290位点TLR3基因分型

两组rs 3775290位点TLR3基因分型、等位基因占比有差异(P<0.05)，见表2。

2.3 不同位点TLR3基因分型者ACA抗体水平对比

rs5743305 TLR3 AA基因型、rs 3775290 TLR3 CC基因型ACA-IgM、ACA-IgG水平高于其它基因型(P<0.05)，而其它基因型比较无差异(P>0.05)。见表3。

表2 两组rs 3775290位点TLR3基因分型占比[例(%)]

表3 不同位点TLR3各基因分型者抗体水平比较

2.4 不同位点TLR3基因多态性与RSA相关性

logitic回归分析，进一步校正年龄等混杂因素后显示，rs5743305携带AA基因型、rs 3775290位点携带CC基因型者发生RSA风险较高(P<0.05)。见表4。

表4 不同位点各基因与RSA相关性

3 讨论

RSA病因复杂，但50%以上RSA 与免疫有关[5-6]。母胎免疫失衡可导致母体对胎儿发生免疫排斥而出现流产现象。NK细胞自然免疫在妊娠耐受过程中发挥重要作用，可调控受精卵着床和子宫血管改变。动物研究显示NK细胞免疫缺陷可导致小鼠生育障碍，通过重建NK细胞可恢复小鼠生育功能[7]。但NK细胞活性过强可导致胚胎吸收，Poly(I-C)可激活NK细胞导致胚胎吸收[8]。TLR 可识别病原微生物保守性分子结构，从而激活天然免疫[9-10]。抗原提呈细胞可识别TLR配体，诱导细胞因子产生，刺激TLR产生，介导获得性免疫应答反应[11]。TLR 与Poly(I-C)相互作用影响妊娠免疫耐受机制，阻断TLR3可消除Poly(I-C)对胚胎吸收的影响。林界等[4]研究显示，在不阻断TLR3情况下，Poly(I-C)显著增加小鼠胚胎吸收率，而阻断TLR3，Poly(I-C)对胚胎吸收率明显下降。张建红[12]研究同样指出子宫局部TLR信号和NK细胞对小鼠妊娠有重要调节作用，TLR3信号激活，NK细胞高度活化，促进母胎界面炎症反应，加剧妊娠中胚胎吸收率。以上结果均提示TLR3在流产发生过程中可能发挥重要作用，其基因多态性是否与RSA易感有关尚待探讨，目前尚缺乏TLR3基因多态性与RSA易感的相关性研究。本研究通过检测TLR3 rs5743305、rs 3775290位点基因多态性，发现RSA患者与正常孕妇基因分型和等位基因存在差异，其中rs5743305位点携带AA基因型、rs 3775290位点携带CC基因型是RSA的易感人群，分别是 rs5743305位点AT、TT基因型人群的1.805、1.352倍，rs 3775290位点CT、TT基因型的1.619、1.937倍，提示TLR3基因变异可能是导致RSA的关键机制之一。

为进一步了解TLR3基因多态性与RSA的关系，本研究观察了TLR3基因多态性与ACA抗体的关系。ACA抗体是自身免疫抗体，其阳性孕妇自然流产率高于阴性孕妇，ACA阳性可引起胎盘部位血管、子宫蜕膜内子宫螺旋动脉出现血栓、动脉粥样硬化等病理改变，并与妊娠期高血压发生有关[13-14]。本研究rs5743305位点携带AA基因型、rs 3775290位点携带CC基因型患者ACA-IgM、ACA-IgG水平高于其它基因型，说明该类人群自身免疫抗体水平偏高，自然流产风险较大，验证了TLR3基因多态性与RSA的相关性，提示TLR3基因变异可能是导致孕妇自身免疫抗体产生的主要因素。

综上，RSA孕妇存在TLR3基因多态性，rs5743305位点携带AA基因型、rs 3775290位点携带CC基因型孕妇发生RSA几率较高。