多囊卵巢综合征患者血清miR-155、PDCD4表达及其临床意义

廉红梅 张 玲 陈德军

1.湖北省妇幼保健院(武汉，430070)；2.华中科技大学同济医学院附属协和医院

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄妇女常见的内分泌代谢异常性疾病，以高雄激素血症及卵巢多囊样改变为主要特征，发病机制不明确[1-2]。miRNA已被证明可作为有效的生物学标记，在PCOS及抗高雄激素治疗中发挥重要作用[3-4]。Arancio等[5]发现miR-155可能在高雄激素性PCOS患者中充当生物标记物，并可用来监测抗雄激素治疗的效果。有文献[6]报道程序性细胞死亡因子(PDCD4)在PCOS妇女体内异常表达，可能进一步促进糖脂代谢紊乱、卵巢颗粒细胞凋亡，在PCOS发生发展中起重要作用。本研究通过检测PCOS患者血清中miR-155、PDCD4表达情况，探讨二者在PCOS发生发展的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2015年10月-2019年12月本院内分泌科诊断为PCOS的患者128例纳入PCOS组。诊断遵照2003年鹿特丹会议修订的PCOS诊断标准。排除标准:①吸烟；②有心血管疾病，肿瘤，肾功能不全，骨质疏松，糖尿病、甲状腺、甲状旁腺及其他内分泌系统疾病；③近3个月口服避孕药、类固醇或其他参与骨代谢和碳水化合物代谢药物；④过去6个月有骨折史以及服用影响维生素K药物。另外随机选取同期本院体检中心健康女性60例(月经规则、性激素水平正常、B超检查排除多囊卵巢)纳入对照组。本研究经本院伦理委员会批准通过，所有样品采集均取得患者及家属知情同意并签字。

1.2 主要试剂与仪器

逆转录RT试剂盒(自武汉纯度生物科技有限公司)，RNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；PCR预混液AceQ qPCR SYBR Green Mix(北京百奥莱博科技有限公司)；PDCD4免疫吸附法(ELISA)试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司)；miR-155、PDCD4及内参Anti-β-actin、U6等引物序列，由上海生工生物公司生产。全自动酶标检测仪(型号Ver1012)购自美国Versamax公司，实时荧光定量PCR仪购自德国QIAGEN Rotor-Gene Q。

1.3 研究方法

1.3.1临床指标检测所有妇女在入院当天测量身高、体重、腰围、臀围、血脂指标、空腹血糖及胰岛素水平。计算体质指数(BMI)，根据BMI将PCOS组分为肥胖组(BMI>25kg/m2)66例、非肥胖组(BMI<25kg/m2)62例。将总胆固醇、高密度脂蛋白、甘油三脂、低密度脂蛋白均在正常值范围内的PCOS患者纳入非脂质异常组(63例)，将上述指标中一项偏离正常范围的PCOS患者纳入脂质异常组(65例)。另根据计算公式：胰岛素抵抗指数=空腹族岛素水平(mU/L)×空腹血糖水平(mmol/L)/22.5，将胰岛素抵抗指数在正常范围PCOS患者纳入非胰岛素抵抗组，指数高于正常范围内的PCOS患者纳入胰岛素抵抗组。

1.3.2血清样品采集及保存各组妇女均在自然月经周期第2～3天取空腹静脉血，分离血清，置-80℃保存用于检测。

1.3.3qRT-PCR法检测血清miR-155水平参照文献[6-8]采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组妇女血清中miR-155水平。采用RNA提取试剂盒(天根)提取血清总RNA，用逆转录试剂盒(Promega)将总RNA(2μg)反转录为cDNA。采用定量PCR仪对miR-155扩增。qRT-PCR反应体系共20μl：miScript SYBR Green Mix 10 μl，cDNA(50 ng/μl)2μl，上下游引物(10 μlM)各1μl，ddH2O 6.0μl。反应条件：95℃，90s；95℃，30s；63℃，30s；72℃，15s；40个循环。miR-155以U6为内参各引物序列见表1。采用2-△△CT法对血清miR-155表达水平进行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.4免疫吸附法(ELISA)检测血清中PDCD4水平参照文献[9]方法，取血用血清，按ELISA试剂盒说明书检测PDCD4含量。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 一般资料比较

PCOS组BMI、胰岛素抵抗指数、总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇水平均高于对照组，高密度脂蛋白胆固醇水平低于对照组(均P<0.05)；两组年龄、舒张压、收缩压、空腹血糖比较无差异(P>0.05)。见表2。

表2 两组一般资料比较

2.2 血清中miR-155、PDCD4表达水平比较

PCOS组miR-155(2.29±0.78/U6)、PDCD4(2.14±0.59 ng/ml)表达水平均高于对照组(1.09±0.58/U6、1.01±0.58 ng/ml)(t=10.61、11.44，均P=0.00)。电泳图见图1。

(a：对照组 b：PCOS组)图1 miR-155 PCR电泳图

2.3 不同临床特征PCOS患者血清中miR-155、PDCD4表达水平比较

PCOS患者miR-155水平及PDCD4蛋白水平，肥胖组均高于对照组和非肥胖组，胰岛素抵抗组高于对照组和非胰岛素抵抗组，脂代谢异常组高于对照组和非脂代谢异常组(均P<0.05)。见表3。

2.4 血清miR-155、PDCD4水平与PCOS相关指标关系

miR-155、PDCD4水平与PCOS患者BM(r=0.37、0.39，P均<0.05)，胰岛素抵抗指数(r=0.45、0.41，P均<0.05)，总胆固醇含量(r=0.47、0.46，P均<0.05)均呈正相关。

表3 各临床特征者血清表达比较

3 讨论

PCOS是引起育龄期女性不孕的主要原因[10]。50%以上的PCOS妇女伴有严重的腹型肥胖症和胰岛素抵抗症，肥胖和胰岛素敏感性可进一步影响PCOS妇女不孕，且多伴有血脂异常等代谢紊乱。预防和治疗肥胖、胰岛素抵抗及改善血脂及内分泌代谢异常是治疗PCOS的关键。

miRNA正常时可调节细胞增殖、发育、分化、死亡、DNA修复、免疫功能等，参与多种疾病的发展过程[3-4]。研究表明，miRNA可在PCOS患者血液、卵泡膜细胞、卵泡液、卵巢颗粒细胞中异常表达，并可能通过调节患者激素分泌代谢、卵泡和卵巢发育等相关基因表达，参与PCOS发病过程[11]。Concha[12]等证明miRNA可能通过调控靶基因和通路蛋白表达，影响卵泡发育、颗粒细胞凋亡、类固醇激素合成和胰岛素敏感性来影响PCOS病理过程。近年研究发现，miR155与激素分泌及卵巢病理过程关系密切。许文丽[13]等发现miR155在子宫内膜癌患者血清中高表达，对诊断子宫内膜癌有较高的临床价值；Arancio[5]等发现miR155在PCOS高雄激素患者血清中有较高表达，推测miR155表达对诊治PCOS高雄激素有潜在应用价值。本研究发现，与对照组相比，PCOS组患者血清miR-155表达增高，提示miR-155可能与PCOS发生有关。且miR-155在PCOS肥胖组、脂质代谢异常组、胰岛素抵抗组患者血清中表达水平均高于非肥胖组、非脂质代谢异常组、非胰岛素抵抗组患者，提示miR-155可能通过调节类固醇激素合成和胰岛素敏感性，参与PCOS患者肥胖、胰岛素抵抗及脂质代谢异常等病理过程，miR-155高表达与PCOS患者肥胖、胰岛素抵抗及脂质代谢异常有一定关系。

PDCD4是一种凋亡相关基因，高表达可影响肥胖、胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱及卵巢颗粒细胞凋亡[6，14]。李红娟[15]等发现抑制PDCD4表达，可抑制PCOS大鼠卵巢颗粒细胞凋亡，促进卵巢颗粒细胞存活；李欣然[16]等发现miR-21可通过抑制PDCD4表达，抑制模型大鼠卵巢早衰。本研究发现，与对照组相比，PCOS组患者血清PDCD4表达均显著增高，提示PDCD4可能与PCOS发生有关。另外肥胖PCOS患者血清PDCD4表达水平显著高于对照组和非肥胖组，脂质代谢异常组PCOS患者血清PDCD4表达水平均显著高于对照组和非脂质代谢异常组，胰岛素抵抗组PCOS患者血清PDCD4表达水平均显著高于对照组和非胰岛素抵抗组，提示PDCD4高表达可能通过影响PCOS患者肥胖、脂质代谢异常及胰岛素抵抗等病理过程，且与PCOS患者肥胖、脂质代谢异常及胰岛素抵抗有一定关系。陆振涛[8]等发现PDCD4为miR-155靶基因，且miR-155及PDCD4在冠状动脉病变患者血液中表达均增高且与病变程度相关。本研究进一步研究发现，血清miR-155、PDCD4水平与PCOS患者体质指数、总胆固醇含量及胰岛素抵抗指数均呈正相关，提示miR-155、PDCD4高表达可能通过某种机制调节类固醇激素分泌和胰岛素敏感性而参与PCOS疾病进程。

综上所述，miR-155及PDCD4在PCOS患者血清中高表达，且与PCOS患者体质指数、总胆固醇含量及胰岛素抵抗指数呈正相关。提示可能通过某种机制参与调控PCOS患者肥胖、脂质异常及胰岛素抵抗的发生发展。但本研究样本量较少，且患者均来自同一地区，还有待后期扩大样本量并联合其他地区资料研究评估。