子宫内膜异位症模型大鼠NF-KB及炎性因子、粘附因子变化及对细胞侵袭和凋亡的影响

叶 黔 张金玲

1.福建医科大学附属南平市第一医院(350000) ；2.暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院

子宫内膜异位症(EM)临床主要表现为月经异常、痛经、慢性盆腔痛、不孕等，并有较高复发率[1]。EM的发生发展是多种发病机制综合作用的结果，包括内分泌因素、免疫紊乱、炎症、遗传因素、新血管生成、干细胞学说等，至今未有明确定论[2]。研究表明，EM患者血清、腹腔液中的各种细胞免疫组分发生了显著变化，异位内膜细胞在远处的粘附、侵袭、种植以及生长也提示免疫和炎症因素在EM的发生进展中起着关键作用[3]。核转录因子KappaB(NF-κB)是真核细胞内多条信号转导途径的交汇点和重要的转录因子，可通过调控其下游炎性因子、粘附因子、趋化因子、集落刺激因子、生长因子、免疫受体等表达广泛参与机体细胞周期、细胞凋亡、免疫反应、炎症反应以及肿瘤形成的调控[4-6]。有研究发现NF-κB的活性状态在异位子宫内膜中高表达，但其在细胞粘附、侵袭和血管生成等炎性反应中的作用机制仍未可知[7]。脯氨酸二硫代氨基甲酸酯(PDTC)作为NF-κB的抑制剂，逐渐用于临床子宫内膜异位症的治疗，通过与子宫孕激素受体结合发挥抗孕激素作用，但具体作用机制及长期疗效仍待观察。本研究探究NF-κB信号通路及其下游炎性因子和粘附因子在EM形成和发展过程中的变化及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD雌性未孕大鼠80只，8周龄，质量(212.54±18.44)g(200～230g)，购自上海中医药大学实验动物中心[许可证号：SCXK(沪)2016-0004]，饲养温度24～26℃，相对湿度50%～65%，昼夜交替12h，期间自由活动与饮食。

1.2 实验动物造模方法

所有大鼠随机分为对照组、模型组、阳性组和PDTC组，每组20只，模型组、阳性组和PDTC组参照有关资料[8]子宫内膜自体盆腔移植法建立子宫内膜异位症大鼠模型，略有改动：每日对大鼠进行阴道涂片检查以确保所有大鼠处于动情周期。模型组、阳性组和PDTC组于术前2d注射0.1ml/kg的苯甲酸雌二醇，第2次注射完毕后，腹腔注射40mg/kg的戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹部备皮，常规消毒后打开腹腔，逐层进腹暴露子宫和卵巢。剥离子宫内膜，将内膜剪成3块，用吸收线分别缝于子宫分叉处、左侧卵巢、左侧腹膜壁层，操作完毕后逐层关腹。术后肌注0.1ml/kg的苯甲酸雌二醇，每隔4d注射1次，共3次；同时肌注0.1ml硫酸庆大霉素预防感染，每天1次，连续注射5d。对照组大鼠则将苯甲酸雌二醇替换为等体积的生理盐水。

1.3 实验动物给药

建模3周后，第2次剖腹检查异位子宫内膜的生长情况，移植灶体积增大呈囊状或透明结节状，内有淡黄色透明囊液积聚者视为造模成功。取建模成功的模型组、阳性组和PDTC组大鼠给药处理：阳性组大鼠腹腔注射0.25mg/kg/d的孕三烯酮(临床子宫内膜异位症常用治疗药)，PDTC组大鼠腹腔注射100mg/kg/d的PDTC溶液(NF-κB抑制剂)，对照组和模型组大鼠腹腔注射等剂量的生理盐水，连续注射21d。大鼠麻醉处死，分离异位子宫内膜，HE染色。

1.4 NF-κB活性检测

处死大鼠，分离各组大鼠异位子宫内膜，采用细胞核/质分离试剂盒(美国Thermo fisher scientific)分离子宫内膜细胞质和细胞核。蛋白上清加入SDS上样缓冲液，金属浴煮沸10min。SDS-PAGE电泳，转膜，5% BSA室温封闭1h，加入封闭液稀释的NF-κB p65、Lamin B1和Tubulin抗体(美国Cell Signaling Technology)，4℃孵育过夜。PBST洗涤3次，每次5min。加入HRP标记的二抗，室温孵育1h ，PBST洗涤3次，每次5min。ECL(美国Thermo Fisher Scientific)化学发光显色，凝胶成像分析系统分析蛋白表达水平。

1.5 细胞因子水平检测

处死大鼠，分离各组大鼠异位子宫内膜，将组织用PBS清洗后充分研磨，12000rcf离心20min，取上清液保存于-80℃备用。采用酶联免疫试剂盒检测组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、细胞粘附分子(ICAM-1)、血管粘附分子(VCAM-1)水平。

1.6 细胞侵袭水平检测

处死大鼠，从大鼠子宫内膜组织中分离培养原代子宫内膜腺上皮细胞(ECCs)，于37℃、5% CO2培养至细胞密度为90%。采用Matrigel侵袭小室分析ECCs的侵袭能力：向Matrigel侵袭小室中加入200μl 5×105个/ml 的ECCs无血清DMEM悬液，向Matrigel下室中加入含20%胎牛血清的DMEM，37℃、5% CO2孵育24h。用棉签轻轻擦掉上室未侵袭的细胞，PBS洗1次，多聚甲醛固定15min。结晶紫染色5min，自来水冲洗，显微镜下随机选取5个视野，统计各组细胞的侵袭个数。

1.7 细胞凋亡水平检测

处死大鼠，分离各组大鼠异位子宫内膜，采用TUNEL法检测各组大鼠异位子宫内膜细胞凋亡情况。每张切片随机采集5个视野，由两位病理科医生采用双盲法分别计数，其中细胞浆中出现棕黄色颗粒记为凋亡细胞，细胞凋亡指数为凋亡细胞所占百分比。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 内膜组织病理观察

对照组大鼠在位子宫内膜细胞呈柱状整齐排列，形态完整；模型组大鼠异位内膜细胞形态和排列方式与对照组相似，但异位病灶囊泡内存在中性粒细胞聚集，周围组织血管丰富；阳性组大鼠异位内膜剥落，存在少量的中性粒细胞聚集，病灶体积减小；PDTC组大鼠异位病灶囊泡中仍有部分中性粒细胞聚集，异位内膜上皮细胞存在剥落现象，见图1(1719页)。

2.2 NF-κB活性比较

图2(1719页)显示，与对照组比较，模型组大鼠子宫内膜细胞核内NF-κB的相对表达水平显著增加，细胞质内NF-κB的相对表达水平明显下降(P<0.05)；与模型组比较，PDTC组大鼠细胞核内NF-κB相对表达水平明显下降，细胞质内NF-κB相对表达水平明显增加(P<0.05)。

2.3 细胞因子水平比较

与对照组比较，模型组大鼠异位子宫内膜TNF-α、IL-6、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1水平增加(P<0.05)；与模型组比较，PDTC组大鼠异位子宫内膜TNF-α、IL-6、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1水平明显下降(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠细胞因子水平比较

2.4 细胞侵袭能力比较

Transwell结果显示，对照组、模型组、阳性组和PDTC组大鼠的细胞穿膜数分别为39.22±3.67、92.18±11.35、49.86±5.01和61.06±5.23，与对照组比较，模型组大鼠的细胞侵袭能力显著增加(P<0.05)；与模型组比较，PDTC组大鼠的细胞侵袭能力明显下降(P<0.05)。见图3(1719页)。

2.5 细胞凋亡水平比较

TUNEL染色显示，对照组、模型组、阳性组和PDTC组大鼠子宫内膜组织的细胞凋亡指数分别为(16.22±1.26)%、(5.69±0.60)%、(27.63±2.29)%、(23.85±2.06)%，与对照组比较，模型组大鼠的细胞凋亡指数显著下降(P<0.05)；与模型组比较，PDTC组大鼠的细胞凋亡指数明显下降(P<0.05)。见图4(1719页)。

3 讨论

EM虽然是一种良性疾病，但却与恶性肿瘤具有相似的生物学行为，如易发生转移和黏连、侵袭和破坏其他组织或器官、血管生成且易复发等。现有病因学将EM解释为免疫性疾病、炎症性疾病、激素依赖性疾病、遗传性疾病、器官依赖性疾病等多种学说，但还未有任何一种理论能够解释EM的具体病因及发病机制[9-10]。尽管Sampson提出的经血逆流种植学说早已被广泛接受[11]，但只有20%的经血逆流妇女才发生EM现象。近年来免疫炎症学说和血管生成学说也逐渐受到大家关注[12-13]。本研究旨在探究EM的发生与免疫功能的改变和血管生成、组织侵袭之间的关系。

NF-κB是由NF-κB/Rel蛋白家族成员以同源或异源二聚体组成的广泛存在于多种细胞的转录因子，激活后的NF-κB进入细胞核，与TNF-α、IL-6、IL-1β等多种炎性因子启动子区域中的κB结合，并参与趋化因子MCP-1、细胞间粘附因子ICAM-1、血管细胞粘附因子VCAM-1、生长因子以及集落刺激因子等的转录[14-15]。已有研究表明炎症反应和血管生成与EM的发病具有明显的相关性[16]。但炎性因子和粘附因子的异常表达是否通过NF-κB信号通路得以实现，且炎性因子和粘附因子的变化如何影响异位内膜细胞的侵袭和凋亡仍未可知。因此深入探究NF-κB对EM免疫炎症、侵袭、凋亡的调节作用对内膜异位发病机制的阐明具有重要价值。

本研究结果显示，EM大鼠内膜细胞内NF-κB的活性增强，炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β和粘附因子ICAM-1、VCAM-1等水平增加，细胞侵袭能力上升，细胞凋亡水平下降；而使用NF-κB抑制剂PDTC处理后，NF-κB活性下降，炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β和粘附因子ICAM-1、VCAM-1等水平下调，细胞侵袭能力下降，细胞凋亡水平增加，表明NF-κB的活性变化及其下游调控因子的表达与EM的发生发展具有明显的相关性。其具体机制可能为：当机体免疫功能处于正常状态时，进入腹腔的活化EM细胞可被局部免疫系统消灭，无法在腹腔内种植生长；而当机体免疫功能处于低下状态时，NF-κB的活性变化使得大鼠体内多种细胞介导的免疫成分如炎性因子和粘附因子的表达发生改变，局部免疫系统不能有效消灭进入腹腔的活化EM细胞，从而促进EM细胞在腹腔内的种植和侵袭。同时异位病灶及其活化的免疫细胞又可进一步促使NF-κB 转录释放更多的炎性介质和细胞因子，促进EM的异位粘附和生长，加重免疫系统的紊乱，恶性反馈促进EM的发展。相关临床研究也表明，EM患者往往伴有体液和细胞免疫功能的异常，具体表现为免疫细胞、炎性因子、粘附因子以及自身抗体产生的改变等[17]。本文结果进一步表明，使用NF-κB抑制剂PDTC处理后，NF-κB的活性受到显著抑制，从而降低其下游相关细胞因子的转录和表达，使子宫内膜异位细胞发生侵袭和增殖。

综上所述，子宫内膜异位大鼠NF-κB的活性上调，并可能通过上调炎性因子和粘附因子的表达，促进内膜细胞的侵袭并抑制其凋亡。