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(1.浙江万里学院生物与环境学院,浙江宁波 315100;2.宁波兰洋水产食品有限公司,浙江宁波 315731)
金枪鱼(Tuna)又名吞拿鱼、鲔鱼,是一种大型远洋性重要商品食用鱼,被称为“海洋黄金”,是世界营养组织推荐的三大营养鱼类之一[1]。金枪鱼可加工成生食鱼片、鱼罐头、鱼松等产品,其中,金枪鱼在加工成鱼柳及金枪鱼罐头时,加工1000 kg约产生300~500 kg的副产物-金枪鱼蒸煮汁(Tuna cooking juice,TCJ),该蒸煮汁富含人体所需且易吸收的氨基酸、可溶性蛋白、核苷酸、不饱和脂肪酸等营养物质,味道鲜美,具有金枪鱼的特有海鲜风味[2]。目前对于金枪鱼蒸煮汁中营养成分的功能性研究已有一些文献报道,如Jao等[3]研究以米曲霉蛋白酶XXIII对金枪鱼蒸煮汁在37 ℃下水解6 h,水解度为25.68%,此水解产物对DPPH的清除率达到82.19%;Kasiwut等[4]对金枪鱼蒸煮汁中的可溶性蛋白用碱性蛋白分别酶解240、120 min后,经纯化制备了分子量分别为238~829和1355~1880 Da的ACE抑制剂和抗凝血剂,对ACE抑制率最高为96.9%±0.54%、抗凝血活性为92.0%±0.75%,表明金枪鱼蒸煮汁是生产功能性食品和生物活性肽的潜在来源。Cheng等[5]用碱性蛋白酶酶解金枪鱼蒸煮汁,得到分子量为204~1672.9 Da的肽组分具有抗炎活性,认为金枪鱼蒸煮汁是食品和营养应用中的有用成分;Kim等[6]研究发现金枪鱼蒸煮汁及其酶解产物对BALB/C小鼠有免疫增强作用;Hung等[7]研究了金枪鱼蒸煮汁的蛋白水解物有抑制乳腺癌细胞生长并诱导其凋亡的作用,可能是抗MCF-7增殖肽的良好蛋白质来源。
但是,与金枪鱼蒸煮汁的基础研究相比较,对金枪鱼蒸煮汁在食品领域的具体产品开发研究还未引起足够的重视,相关文献报道较少。陈启航等[8]将金枪鱼蒸煮汁酶解后再调配开发生产为具有海鲜风味的调味汁;何键东[9]研究了用蛋白酶酶解金枪鱼蒸煮汁提取鱼油、多不饱和脂肪酸以及金枪鱼鱼油的微胶囊化。但更多的情况是企业将其当废液排放,这既是对宝贵资源的浪费也会带来环境污染。
沙拉酱是西方人餐桌上必不可少的调味酱,已成为世界上最受欢迎的酱汁之一[10]。传统沙拉酱是以植物油、水、蛋黄、食醋为主要原料,再加上调味料和香辛料等经调制乳化而成的一种粘稠状半固体食品[11]。由于传统沙拉酱的主要原料是植物油和鸡蛋黄,存在“高脂肪、高热量、高胆固醇”问题,开发低脂健康型风味沙拉酱成为必然趋势[12]。
本研究在对金枪鱼蒸煮汁的营养成分测定、抗氧化性分析的基础上,将金枪鱼蒸煮汁这种营养价值极高的加工副产物作为沙拉酱的主原料,不添加额外的油脂和鸡蛋,充分利用金枪鱼蒸煮汁中自身的优质蛋白和油脂,并对金枪鱼蒸煮汁进行脱腥预处理,以产品感官评价为指标,通过对主要因素的单因素实验结合响应面试验进行配方优化,得到了金枪鱼风味沙拉酱的配方。以期达到人们对低脂、高蛋白、有抗氧化功效的风味沙拉酱的消费需求,同时也丰富金枪鱼加工产品类型、增加金枪鱼加工链中产品的附加值的目的。
金枪鱼蒸煮汁 宁波兰洋水产食品有限公司;羟丙基二磷酸酯淀粉(410变性淀粉) 东莞东美食品公司;KA66酵母抽提物(批号2017012202E9) 安琪酵母股份有限公司;碱性蛋白酶(20万U/g) 宁波丰肽生物科技公司提供;黄原胶 南京松冠生物科技有限公司;食盐、白砂糖、白醋等 市售;Folin-酚甲、乙液 北京索莱宝科技有限公司;牛血清蛋白(AR) 上海申航生物科技有限公司;DPPH、ABTS 梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。
T6新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;K9860全自动凯氏定氮仪 山东海能科学仪器有限公司;PEN3型便携式电子鼻 德国AIRSENSE公司。
1.2.1 金枪鱼蒸煮汁的营养成分测定
1.2.1.1 氨基态氮含量测定 参照GB/T 5009.39-2016《酱油卫生标准的分析方法》[13]测定。
1.2.1.2 可溶性蛋白含量测定 福林酚法测定[14]。取6支试管分别加入0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL牛血清蛋白溶液(0.250 mg·mL-1),补足蒸馏水至1.00 mL,加入福林酚甲液5 mL,室温静置10 min后,加入0.5 mL乙液反应30 min,于500 nm测定A值,得标准曲线y=0.0006x+0.0045(R2=0.9930),线性范围0.025~0.250 mg·mL-1。样品测定:取1.00 mL样品液,按上述方法测定A500,平行测定三次,计算可溶性蛋白含量。
1.2.1.3 总蛋白含量测定 参照GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》[15]测定。
1.2.1.4 脂肪含量测定 参照GB 5009.6-2016《脂肪含量的测定》[16]测定。
1.2.2 金枪鱼蒸煮汁抗氧化活性测定
1.2.2.1 金枪鱼蒸煮汁对·OH的清除效果 吸取9 mmol·L-1水杨酸-乙醇溶液0.5 mL、9 mmol·L-1硫酸亚铁溶液1 mL于试管中,再加入可溶性蛋白浓度分别为0.11、0.16、0.22、0.28、0.35 mg·mL-1的金枪鱼蒸煮汁1 mL,最后加8.8 mmol·L-1过氧化氢1 mL,并加蒸馏水补足到15 mL,37 ℃水浴30 min;以蒸馏水1 mL代替样品作为空白对照,于510 nm测定样品和空白对照的吸光度,分别记为AX和A0。同时,以9 mmol·L-1硫酸亚铁溶液1 mL、9 mmol·L-1水杨酸-乙醇溶液0.5 mL,不同浓度的样品溶液1 mL作为样品溶液本底吸光度,记为AX0。同时,以26.7、40.0、53.3、66.7、80.0 μg·mL-1维生素C为对照[17]。
1.2.2.2 金枪鱼蒸煮汁对DPPH自由基的清除效果 在3 mL含0.15 mmol·L-1DPPH自由基的溶液中,分别加入可溶性蛋白浓度为1.0、2.1、4.2、6.2、8.3 mg·mL-1的样品液1 mL,混匀,避光静置30 min,于517 nm处测定吸光度,记为Ax;同时,以对应的待测液和3 mL不含DPPH自由基的溶液作样品对照,测定吸光值,记为Ax0;1 mL水和3 mL的DPPH自由基溶液作空白组,测定吸光值,记为A0。同时,以0.27、0.41、0.54、0.68、0.81 μg·mL-1维生素C为对照[17]。
1.2.2.3 金枪鱼蒸煮汁对ABTS自由基的清除效果 取ABTS自由基工作液3 mL,分别加入可溶性蛋白浓度为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg·mL-1的样品液1 mL,将其混匀后,25 ℃避光反应10 min,在732 nm波长处测定样品吸光度,记为Ax;其余同1.2.2.2项。按下式计算ABTS自由基清除率。同时,以0.84、1.67、2.51、3.34、4.18 μg·mL-1维生素C为对照[17]。
清除率(%)=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100
式中:A0:空白对照液吸光度;Ax:加入样品溶液的吸光度;Ax0:样品溶液本底的吸光度。
1.2.3 金枪鱼蒸煮汁的脱腥实验
1.2.3.1 金枪鱼蒸煮汁的脱腥处理 a.酵母抽提物脱腥:80 g金枪鱼蒸煮汁+0.4 g酵母抽提物,混匀,于30~45 ℃处理50 min。b.酵母抽提物-酶解脱腥:在酵母抽提物脱腥的基础上用NaOH调金枪鱼汁的pH至9~10,再加0.0090 g碱性蛋白酶在55 ℃下酶解1 h,再在100 ℃煮沸灭酶5 min,最后加0.6 g柠檬酸调金枪鱼汁pH至6~7。以80 g金枪鱼蒸煮汁为对照原液。
1.2.3.2 脱腥效果的电子鼻检测方法 分别称取1.2.3.1中的样品10 g于20 mL顶空瓶中,于25 ℃平衡30 min,通过PEN3型电子鼻传感器进行检测。数据采集时间为对照原液、酵母抽提物脱腥液均为300 s,酵母抽提物-酶解脱腥液150 s,传感器每次清洗时间为40 s。取平稳状态的测量数据作为分析点,每组样品平行5次。运用PEN3型传感器配套的WinMuster软件对数据进行主成分(Principal component analysis,PCA)和线性判别(Linear discriminant analysis,LDA)分析[18]。
1.2.4 金枪鱼沙拉酱的制备工艺
1.2.4.1 沙拉酱基本工艺 工艺流程见图1。在金枪鱼蒸煮汁中加入酵母抽提物混匀,于30~45 ℃放置50 min,再将淀粉、黄原胶、以及白砂糖、食盐(可酌情添加)等加入脱腥后的金枪鱼蒸煮汁中搅匀,加热到50~100 ℃,进行乳化、增稠、调味,再用匀浆机对其充分乳化均匀,将体系温度降至50 ℃时再加入白醋、山梨酸钾,搅拌均匀即得到金枪鱼风味沙拉酱产品。
图1 金枪鱼风味沙拉酱制备工艺流程图Fig.1 Processing flow chart of tuna-flavored salad
1.2.4.2 金枪鱼沙拉酱配方的单因素实验 以黄原胶添加量(0.0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%)、食盐添加量(0.5、1.0%、2.0%、3.0%、4.5%)、白砂糖添加量(0.0、5.0%、10.0%、15.0%、20.0%)、酵母抽提物添加量(0.0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%)为单因素,各因素的固定水平为黄原胶0.5%、食盐1.5%、白砂糖10%、酵母抽提物0.4%进行实验,评定各因素对产品感官指标的影响。
1.2.4.3 金枪鱼沙拉酱配方的响应面优化实验 在单因素实验数据的基础上,黄原胶对沙拉酱的形态、涂抹性、口感影响大,酵母抽提物对金枪鱼汁原料的鱼腥味以及沙拉酱的风味影响大,食盐对沙拉酱的口感有综合影响,因此选择黄原胶、酵母抽提物以及食盐的添加量三个因素进行响应面优化实验,感官评价为指标,实验因素及水平见表1。
表1 响应面因素-水平表Table 1 Factors and levels of response surface
1.2.4.4 感官评价标准 选10名(5男5女)身体健康,味觉、嗅觉、视觉正常的学生,对沙拉酱成品从形态、色泽、气味以及口感4个方面做出总体评价。满分100分,感官评分=30%形态+20%色泽+20%气味+30%口感,取10人平均分,评分标准参见文献并调整[8,11],见表2。
表2 感官评分参考标准Table 2 Sensory scoring of reference criteria
数据采用excel中的X±S表示,响应面实验采用Design-Expert V 8.0.6软件。
图2 金枪鱼蒸煮汁可溶性蛋白对OH、DPPH、ABTS+自由基的清除率Fig.2 Scavenging rate of hydroxyl,DPPH,ABTS+ free radicals by soluble protein of tuna cooking juice
由表3可知,金枪鱼蒸煮汁中富含蛋白质且主要是可溶性蛋白,还含有游离氨基酸,这有利于人体的吸收,含有少量脂肪,有文献报道[9]金枪鱼中的脂肪多属于不饱和脂肪酸,对预防心血管疾病有益。金枪鱼蒸煮汁中的可溶性蛋白和脂肪含量对于其风味沙拉酱开发奠定了营养物质基础。
由图2可知,以维生素C为对照,金枪鱼蒸煮汁可溶性蛋白对OH、DPPH、ABTS自由基清除率均随浓度增加而增加,且存在量效关系。当金枪鱼蒸煮汁可溶性蛋白为0.35 mg·mL-1时,对羟自由基清除率达到94.99%;当金枪鱼蒸煮汁可溶性蛋白8.3 mg·mL-1时,对DPPH自由基清除率达到95.26%;当金枪鱼蒸煮汁可溶性蛋白浓度为1.2 mg·mL-1时,对ABTS自由基清除率达到90.19%。金枪鱼蒸煮汁表现出良好的抗氧化活性。
2.3.1 不同脱腥工艺样品的主成分分析 PCA分析法可从多元变量中得出最主要和贡献率最大的因子,从而观察并比较不同样品的主成分分析值在空间的分布差异。图3中每个椭圆区域代表同条件下三种样品气味的数据采集点。由图3可知第一主成分贡献率为79.22%,第二主成分贡献率为19.07%,总贡献率为98.29%>85%,说明主成分分析图能很好的反映出样品的整体信息[19]。酵母抽提物+酶解脱腥样品与另两个样品没有重叠,说明(酵母抽提物+酶解)脱腥工艺得到样品的气味成分与对照原液和酵母抽提物脱腥液的气味有明显区别;金枪鱼原液与酵母抽提物脱腥液有部分重合,说明两者含有共同的气味成分。
图3 不同脱腥工艺对金枪鱼蒸煮汁样品的电子鼻主成分(PCA)分析Fig.3 PCA analysis of electronic nose for tuna cooking juice by different deodorization
2.3.2 不同脱腥工艺样品的线性判别分析 线性判别分析法(linear discriminant analysis,LDA)在于区分样品的品种间和空间分布的差距,使不同类别的数据差异达到最大,提高分类的精密度[20]。由图4可以看出三组样品均无重叠部分,表明这三组样品气味存在较大差异。即经过脱腥工艺得到的金枪鱼汁气味与原液有区别,且两种不同脱腥工艺得到的金枪鱼汁气味也有区别。
图4 不同脱腥工艺对金枪鱼蒸煮汁样品的电子鼻线性判别分析Fig.4 LDA analysis of electronic nose for tuna cooking juice by different deodorization
2.3.3 不同脱腥工艺样品的气味测定结果 将每组样品的传感器响应值做均值处理,数据结果见图5。三组样品各传感器间存在明显差异,其中,数值最高为W1W,其次是W5S、W2W传感器,剩余传感器差异不大。W1W、W5S、W2W传感器分别代表无机硫化物、氮氧化物、有机硫化物(这三类物质都是赋予样品特殊气味),分析三组样品的气味,响应值大小次序是对照原液>酵母抽提物脱腥液>酵母抽提物+酶解脱腥液,表明原液鱼腥味最重,酵母抽提物脱腥液次之,再是酵母抽提物+酶解脱腥液。而酵母抽提物+酶解法的脱腥液虽然鱼腥味最低,但是鱼的风味改变较大,失去了金枪鱼蒸煮汁原有的鱼香味,因此,选择酵母抽提物作为脱腥处理工艺。
图5 不同脱腥工艺对金枪鱼蒸煮汁的电子鼻响应峰值Fig.5 Response value of electronic nose sensor to tuna cooking juice samples by different deodorization processes注:W1C:芳香苯类;W5S:氮氧化物;W3C:氨类;W6S:氢气;W5C:烷烃;W1S:甲烷;W1W:无机硫化物;W2S:乙醇;W2W:有机硫化物;W3S:芳香烷烃。
分析酵母抽提物(KA66型)对金枪鱼蒸煮汁脱腥的原因是[21]:酵母抽提物主要成分为多肽、氨基酸、呈味核苷酸、B族维生素及微量元素,其中氨基酸含量达到约22%~25%。酸性氨基酸能与碱性胺类发生反应,降低三甲胺含量,从而降低腥味,同时还能增加蒸煮汁的鲜味并除去苦味、屏蔽异臭。所以选择酵母抽提物作为金枪鱼蒸煮汁的脱腥处理既能脱腥又能保留其风味,且工艺简单可行。
金枪鱼风味沙拉酱基本配方为金枪鱼蒸煮汁、410 变性淀粉、黄原胶、酵母抽提物、食盐、白砂糖、料酒、白醋、山梨酸钾。其中 410 变性淀粉和黄原胶是影响沙拉酱的外观形态、粘稠性、流变性、涂抹性以及口感的主要因素,根据复配测试,410变性淀粉和黄原胶对沙拉酱增稠有协同效应。酵母抽提物主要是降低金枪鱼蒸煮汁的腥味,食盐、白砂糖、料酒和白醋不仅改善丰富沙拉酱的口味,而且也有降低腥味的的作用,山梨酸钾为防腐剂。根据这些成分的作用,在沙拉酱研制过程中,主要选取黄原胶、酵母抽提物、食盐以及白砂糖4个因素进行单因素实验。
2.4.1 黄原胶添加量 本实验固定410变性淀粉添加量为4%时,改变黄原胶添加量。金枪鱼沙拉酱的粘度随着黄原胶添加量增多而增大,见图6,当黄原胶添加量从0.4%增加到0.6%时,沙拉酱的粘度急剧变化,得到的产品流变性和涂抹性也发生急剧变化;黄原胶过少或过多都会使金枪鱼沙拉酱的感官评分值下降,见图7。综合粘度、外观、涂抹性、口感,黄原胶添加量选择0.5%。
图6 黄原胶添加量对金枪鱼沙拉酱粘度影响Fig.6 Effect of xanthan gum addition on the viscosity of tuna salad paste
图7 黄原胶添加量对金枪鱼沙拉酱感官评分影响Fig.7 Effect of xanthan gum addition on the sensory scores of tuna salad paste
2.4.2 食盐添加量 食盐主要影响沙拉酱的口味且有一定去腥作用。图8看出,食盐添加量过多则沙拉酱口味偏咸,食盐添加量过少则沙拉酱口味偏淡,都会使金枪鱼沙拉酱的感官评分值下降。当食盐添加量为1.5 g时,金枪鱼沙拉酱的感官评分值最高。
图8 食盐添加量对金枪鱼沙拉酱感官评分影响Fig.8 Effect of salt addition on sensory scores of tuna salad paste
2.4.3 白砂糖添加量 添加一定量白砂糖,可以起到丰富咸味沙拉酱的口感风味。由图9可看出白砂糖添加量为10%时,配制的金枪鱼沙拉酱的感官评分最高。
图9 白砂糖添加量对金枪鱼沙拉酱感官评分影响Fig.9 Effect of sugar content on sensory score of tuna salad paste
2.4.4 酵母抽提物添加量 在金枪鱼蒸煮汁中添加酵母抽提物可以达到去腥和提升鱼鲜味的效果。由图10看出,随着酵母抽提物添加量的增加,当添加量在0.4%以上时金枪鱼沙拉酱的感官评分趋于平稳。
表5 回归模型的方差分析Table 5 Analysis of variance of regression model
图10 酵母抽提物对金枪鱼沙拉酱感官评分影响Fig.10 Effect of yeast extract on sensory score of tuna salad paste
2.5.1 回归模型的确定 配方优化的响应面实验及方差分析结果见表4、表5。各因素间相关的二次回归方程:Y=97.02-0.53A+1.31B+1.95C+1.41AB-1.04AC+0.59BC-3.00A2-2.42B2-3.32C2。
图11 酵母抽提物、黄原胶和食盐添加量的交互作用对沙拉酱感官评分的影响Fig.11 Effects of interaction of yeast extracts,xanthan gum and salt addition on sensory scores of salad paste
由表5可以看出,模型P<0.001,失拟项=0.3052>0.05,表示该回归模型显著,能够对沙拉酱配方很好的分析。其中B(酵母抽提物)、C(黄原胶)、AB、A2、B2、C2对结果影响极显著(P<0.01),而A(食盐)、AC表示差异显著(P<0.05),BC因P值>0.05,表示差异不显著。根据P值得出影响金枪鱼沙拉酱感官评分因素的大小顺序是C(黄原胶添加量)>B(酵母抽提物添加量)>A(食盐添加量)。相关系数R2=0.9854,模型信噪比(S/N)=18.485,一般认为模型的可接受信噪比大于4,说明模型的拟合度和可信度较高[22]。C.V.变异系数=0.67,越小表明实验的可靠性越好。
2.5.2 响应曲面图分析 图11是各因素的响应面图,响应曲面中等高线的曲率大小可以直接反映出因素之间的交互作用对响应值影响的程度,曲率越大并呈现椭圆形表示两因素的交互作用对响应值的影响显著。本实验中交互项 AB对响应值的影响极显著(P<0.01)、AC 对结果影响显著(P<0.05),BC 对结果影响无显著影响。
通过响应面软件分析得出上述四个因素的最优取值,即黄原胶添加量为0.53%、酵母抽提物添加量为0.45%、食盐添加量为1.42%,感官评分为97.56分。为验证实验可靠性,做三次平行实验,感官评分为97.31±0.08分。因此该模型是合理有效的。
根据单因素实验和响应面优化实验结果,研制的金枪鱼风味沙拉酱的最佳配方及产品主要质量指标(卫生指标未检测)如表6。质量指标参见《中华人民共和国国内贸易行业标准-沙拉酱》[23]。
在金枪鱼罐头加工过程中会产生大量的金枪鱼蒸煮汁,由于金枪鱼蒸煮汁含有丰富的可溶性蛋白和不饱和脂肪酸,这些营养成分还具有一定的抗氧化性,当以金枪鱼蒸煮汁中可溶性蛋白浓度为0.2、8.3、1.2 mg·mL-1计时,分别对OH、DPPH、ABTS自由基清除率可达到90%以上。基于金枪鱼蒸煮汁的营养价值和抗氧化性,以及原料自身的属性,本项目以此为原料开发了金枪鱼风味沙拉酱,这既是对资源的综合利用又为市场提供了有特色的海鲜沙拉酱产品。
表6 金枪鱼风味沙拉酱的最佳配方和质量指标Table 6 Optimum formula and quality index of tuna-flavored salad dressing
金枪鱼蒸煮汁制备沙拉酱的工艺主要是原料脱腥与调配两大步骤。以感官评价为判定指标,通过单因素和响应面实验对影响沙拉酱外观、色泽、气味、口感的主要因素酵母抽提物、黄原胶、食盐、白砂糖的添加量进行了优化,最终确定了金枪鱼风味沙拉酱的配方为:金枪鱼蒸煮汁80 g/100 g、黄原胶0.53 g/100 g、酵母抽提物0.45/100 g、食盐1.42/100 g、410变性淀粉4/100 g、白砂糖10/100 g、料酒2.5/100 g、白醋1/100 g、山梨酸钾0.1/100 g。此配方制作的沙拉酱呈现均匀的淡黄色、流散缓慢、粘稠度适中、组织细腻、咸甜适中,具有金枪鱼的风味。