加压毛细管电色谱测定甘蔗中三种多酚类化合物

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(1.广西科技大学生物与化学工程学院,广西柳州 545006;2.广西科技大学医学院,广西柳州 545005)

多酚类化合物普遍存在于植物界,是植物中丰富的次级代谢产物[1-2],具有很高的抗氧化能力[3]。有研究表明,多酚类化合物还有许多生物特性,如抗炎、抗过敏、抗菌、保护心脏等[4-6]。由于多酚化合物具有较高的利用价值,应用广泛,因此,各类植物、食品中多酚化合物的分离、检测及其质量控制等方面引起了众多研究者的关注[7-9]。

甘蔗广泛分布于温带和热带地区,其含糖量高,主要用作生产糖和酒精[10]。甘蔗在加工过程中会产生大量的副产物如甘蔗渣。研究表明,甘蔗是多酚含量较高的植物,在蔗叶、蔗梢、蔗茎中均含有大量的高分子多酚类化合物,其多酚含量均在为500 mg/kg以上[11-14]。多酚类化合物可与多酚氧化酶作用引起酶促褐变反应,使蔗糖颜色加深[15-16]。为了提高对甘蔗渣的充分利用率,并对蔗糖进行质量控制,因此有必要对多酚类化合物的提取、分离及检测进行进一步研究。

甘蔗中可检测多酚类化合物含量较低,干扰成分较多且基底复杂,目前,对于甘蔗中多酚分离检测的研究相对较少,且不充分。目前常用的多酚的分析方法为高效液相色谱法[17-18]和毛细管电泳法[19],但高效液相色谱法多采用梯度洗脱且分析时间较长,毛细管电泳法分析快速却常出现干柱和气泡问题,影响柱效。加压毛细管电色谱(pCEC)是 21 世纪初发展起来的一种新型分离技术,将液相色谱与毛细管电泳结合,实现以压力流和电渗流作为双重驱动力,解决了高效液相色谱法分析时间长和毛细管电泳法的干柱和气泡问题,达到更加快速、高效的分离检测目的[20-21]。目前加压毛细管电色谱在药品、食品、环境安全等方面已得到广泛应用[22-24]。本文利用加压毛细管电色谱,对影响分离检测的色谱条件流动相比例、缓冲盐种类、浓度及pH、离子对试剂浓度、分离电压、流速等进行优化,建立了分离检测甘蔗中绿原酸、阿魏酸、表儿茶素的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甘蔗 广西柳州;绿原酸、阿魏酸、没食子酸标准品 上海安谱实验科技股份有限公司;甲醇 色谱纯,德国Merck 公司;庚烷磺酸钠 色谱纯,天津市化学试剂研究所;磷酸二氢钠、乙酸钠、乙酸铵、氢氧化钠、盐酸、乙酸乙酯 分析纯,广东汕头市西陇化工厂;实验用水 均为超纯水。

TriSepTM-2100 加压毛细管电色谱 上海通微分析技术有限公司;UV-2102PC型紫外-可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;RE-5203旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 精密称取绿原酸、阿魏酸、表儿茶素标准品各25 mg,分别置于25 mL棕色容量瓶,用甲醇溶解并定容,配制成1 mg/mL的标准溶液。用甲醇按梯度将其分别稀释为20、40、80、160、320 μg/mL的标准溶液。所有标准溶液均在4 ℃下避光保存。

1.2.2 混合标准溶液的配制 分别精密吸取1 mg/mL的绿原酸、阿魏酸、表儿茶素标准溶液各80 μL,用甲醇稀释至1 mL,作为混合标准溶液备用。

1.2.3 多酚的提取 参考Fang等[25]的提取方法,将所购甘蔗去皮后榨去蔗汁,取甘蔗渣适量干燥后,研磨成粉。准确称取甘蔗渣粉末10.00 g,加入1 mol/L NaOH溶液150 mL,室温下磁力搅拌6 h后,用6 mol/L HCl溶液调节pH至2.0,移至分液漏斗中,用乙酸乙酯萃取三次,将萃取液放至旋转蒸发仪中,40 ℃旋转蒸干,得到红棕色膏状物(为萃取后除脂及多糖之后,富含多酚类化合物的混合物),放至冰箱4 ℃保存。取适量上述棕红色膏状物,用甲醇溶解,通过0.20 μm的针式微孔滤膜过滤,冰箱4 ℃保存备用。

1.2.4 pCEC色谱条件 色谱柱:毛细管填充柱(EP-100-20/45-3-C18,内径100 μm,总长度45 cm,有效长度20cm,填料为内径3 μm OSD);流动相:15.0 mmol/L NaH2PO4+12.5 mmol/L庚烷磺酸钠(pH5.0)/甲醇(50∶50,V/V);流动相总流速:0.06 mL/min;分离电压:1 kV;检测波长220 nm;分流阀压力调至10.5 MPa。

1.3 数据处理

采用TriSepTM-2100加压毛细管电色谱系统(上海通微公司)采集数据,Microsoft Excel 2010和Origin 8.0软件进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 pCEC色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择 用紫外分光光度计在200～400 nm范围内分别对浓度均为80 μg/mL的绿原酸、阿魏酸、表儿茶素标准溶液进行扫描,结果如图1所示,三种多酚在220 nm处都有较强的紫外吸收,因此选择220 nm作为检测波长。

图1 紫外吸收色谱图Fig.1 Ultraviolet absorption chromatogram注:1:绿原酸;2:阿魏酸;3:表儿茶素;图2～图9同。

2.1.2 有机相比例的优化 有机相在流动相中所占比例会影响样品在固定相和流动相之间的分配比例,进一步改变分离选择性。实验考察了甲醇比例分别为60%、55%、50%、45%及40%对绿原酸、阿魏酸、表儿茶素分离的影响。取“1.2.2”所配混合标准溶液,按照“1.2.4”所述 pCEC色谱条件进行分离检测(图2～图8均在此条件下检测)。如图2所示,随着甲醇比例为逐步降低,三种多酚类化合物的出峰时间逐步增加,60%甲醇时,绿原酸和阿魏酸分离度较低且表儿茶素峰型较差;55%甲醇时,表儿茶素峰形拖尾;50%甲醇时,三种多酚可得到较好的基线分离,保留时间较短,峰形较好,理论塔板数较高;随着甲醇比例的进一步降低,即甲醇比例为45%和40%时,三种多酚类化合物保留时间较长,不利于快速分离检测。因此,实验选择50%甲醇作为最优有机相比例。

图2 不同甲醇比例电色谱图Fig.2 pCEC electropherograms at different methanol ratios

2.1.3 缓冲溶液种类的优化 pCEC分离系统中,为了形成稳定的电场和电渗流,需要在流动相中加入可以导电的酸碱或者缓冲盐溶液。实验分别考察了浓度均为15 mmol/L的CH3COONa、CH3COONH4、NaH2PO4缓冲溶液对上述三种多酚类化合物的分离影响。如图3所示,当流动相中加入CH3COONa缓冲溶液时,表儿茶素峰形前沿,峰宽较宽;流动相中加入CH3COONH4缓冲溶液时,绿原酸、阿魏酸、表儿茶素均峰形拖尾或前沿,柱效较低;而采用NaH2PO4缓冲溶液时,三种多酚类化合物的峰形得到明显改善,减轻或消除了拖尾或前沿现象,峰形较为对称,柱效较高。因此,实验选择NaH2PO4作为流动相中添加的缓冲盐。

图3 不同缓冲盐电色谱图Fig.3 pCEC electropherograms at different buffer salt

2.1.4 缓冲溶液浓度的优化 缓冲盐溶液浓度决定了Zeta电位、双电层厚度和毛细管内壁表面电荷超量等,对样品的分离、样品峰柱效等有着明显的影响,因此,实验进一步考察了NaH2PO4缓冲溶液浓度分别为10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 mmol/L时对绿原酸、阿魏酸、表儿茶素分离的影响。结果如图4所示。随着NaH2PO4缓冲溶液浓度的增加,三种多酚峰形改善、柱效升高,但当NaH2PO4浓度过高时,电流值增大,产生较高的焦耳热,反而造成峰形拖尾,柱效下降。综合考虑,实验选择15.0 mmol/L NaH2PO4作为最优缓冲盐浓度。

图4 不同浓度NaH2PO4电色谱图Fig.4 pCEC electropherograms of NaH2PO4 at different concentrations

2.1.5 离子对试剂浓度的优化 由于绿原酸、阿魏酸、表儿茶素以及甘蔗中干扰成分结构相似,含有较多酚羟基,且甘蔗中干扰成分众多,均导致了待测样品分离难度。而离子对试剂可通过与带电荷分析物结合,形成配对离子,从而选择性增加带电荷分析物的保留时间,因此在缓冲盐溶液中加入一定浓度的离子对试剂,可改善三种多酚之间以及多酚与甘蔗中其它干扰成分的分离。实验采用庚烷磺酸钠作为离子对试剂,并考察了当庚烷磺酸钠浓度分别为5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mmol/L时的三种多酚的分离情况。如图5所示，随着庚烷磺酸钠浓度的升高,三种多酚的分离度越来越好,保留时间逐步缩短,当庚烷磺酸钠浓度为15.0 mmol/L时,阿魏酸、表儿茶素峰出现拖尾和前沿,分离度下降。综合分离度和保留时间,选择12.5 mmol/L庚烷磺酸钠作为最优离子对试剂浓度。

图5 不同浓度离子电色谱图Fig.5 pCEC electropherograms of ion pair reagent at different concentration

2.1.6 流动相pH的优化 绿原酸、阿魏酸、表儿茶素都含有酚羟基,容易在溶液中电离,呈现出一定酸性。pH可通过改变三种多酚类化合物的电离情况,从而通过改变其电色谱行为,改变其分离情况。实验考察了不同pH的NaH2PO4缓冲溶液对三种多酚的分离情况。如图6所示，缓冲盐溶液pH分别为3.5、4.0、4.5时,随着pH的增大,三种多酚的保留时间逐步减小,三种多酚的分析周期仍较长,不利于其快速分离测定;pH5.0时,三种多酚保留时间进一步减小,但峰形和分离度很好;pH5.5时,由于产生过大的电渗流,分析周期最短,但表儿茶素峰型也受到影响。因此,选择pH5.0作为流动相的最优pH。

图6 不同pH下电色谱图Fig.6 pCEC electropherograms at different pH

2.1.7 分离电压的优化 随着施加电压的增大,会产生大量的焦耳热,从而影响电渗流的大小,进一步影响柱效。实验考察了分别在-3、-1、0、1、3 kV电压下三种多酚的分离效果,结果如图7所示。当施加负压时,三种多酚保留时间较短,当施加电压为-3 kV时,绿原酸与阿魏酸峰重叠。当施加电压为-1 kV时,阿魏酸与表儿茶素峰无法完全分离;当施加正压时,三种多酚保留时间延长,但分离度较负压好。当施加电压为1 kV时,三种多酚的分离度高且峰型较好;当施加电压为3 kV时,阿魏酸峰型较差,柱效下降,且保留时间过长。因此,选择1 kV作为最优分离电压。

表1 绿原酸、阿魏酸、表儿茶素的线性范围、回归方程、相关系数(r)、检出限Table 1 Linear range,regression equation,correlation coefficient(r)and LODs of chlorogenic acid,ferulic acid and epicatechin

图7 不同分离电压下电色谱图Fig.7 pCEC electropherograms at different voltages

2.1.8 流动相流速的优化 流速的大小直接影响了柱压,从而影响各组分保留时间的长短以及分离情况,实验考察了流动相流速分别为0.05、0.06、0.07 mL/min时绿原酸、阿魏酸、表儿茶素的分离情况。如图8所示,随着流动相流速的增大,三种多酚的保留时间缩短,分析时间减少,分离度下降。当流动相处于较低流速时,三组分峰形展宽,柱效下降;当流动相处于较高流速时,柱压上升,表儿茶素峰型变差;在流速为0.06 mL/min时,三组分之间分离度好且仍能达到基线分离。因此,实验选择0.06 mL/min为最佳流动相流速。

图8 不同流速下电色谱图Fig.8 pCEC electropherograms at different flow rates

2.2 方法学验证

2.2.1 线性范围和检出限 取“1.2.1”所配制的标准溶液,按照“1.2.4”所述色谱条件进行分析,以质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。如表1所示,绿原酸、阿魏酸、表儿茶素在20～320 μg/mL范围内线性关系良好,相关系数(r)在0.9922～0.9978之间,检出限(LODs,S/N=3)分别为0.14、0.75、1.65 μg/mL。

2.2.2 精密度 分别取80 μg/mL的绿原酸、阿魏酸、表儿茶素标准溶液,连续进样五次,结果显示,绿原酸、阿魏酸、表儿茶素的相对标准偏差值分别为2.82%、2.69%、1.18%,表明仪器精密度良好。

2.2.3 样品分析 将提取的样品溶液,按照“1.2.4”所述 pCEC色谱条件进行分离检测,结果如图9。计算测得甘蔗渣中绿原酸、阿魏酸、表儿茶素的含量分别为135.68、99.66、21.98 μg/mL。

图9 三种多酚混合标准溶液及甘蔗样品电色谱图Fig.9 pCEC electropherograms of three polyphenol mixed standard solutions and sugarcane samples注:a:混合标准溶液;b:样品。

2.2.4 回收率 对样品中的绿原酸、阿魏酸、表儿茶素进行加标回收率测定,结果如表2所示,绿原酸、阿魏酸、表儿茶素的回收率均良好,在96.79%～100.71%之间,RSD为2.24%～3.09%,表明该方法具有较好的准确度和重现性,适合甘蔗中多酚类化合物的分离检测。

表2 甘蔗中绿原酸、阿魏酸、表儿茶素加标回收率(n=3)Table 2 Recovery of chlorogenic acid,ferulic acid and epicatechin in sugarcane(n=3)

3 结论

本实验建立了加压毛细管电色谱分离甘蔗中绿原酸、阿魏酸、表儿茶素的方法,优化了流动相比例、pH、缓冲盐浓度、分离电压、流速等色谱条件。在流动相为15.0 mmol/L NaH2PO4+12.5 mmol/L庚烷磺酸钠(pH5.0)/甲醇(50∶50,V/V);分离电压为1 kV;流动相总流速为0.06 mL/min;检测波长为220 nm的色谱条件下,绿原酸、阿魏酸、表儿茶素在线性范围为20～320 μg/mL的检出限分别为0.14、0.75、1.65 μg/mL,加标回收率为96.79%～100.71%,RSD为2.24%～3.09%。该方法快速、高效,可用于甘蔗中绿原酸、阿魏酸、表儿茶素的分离检测。