纳米ZnO-Ag复合材料对小麦根腐病菌侵染下小麦幼苗生长的影响

郭艾英，许晓越，杨晓妮，齐艳玲，蔡爱军

(河北科技师范学院农学与生物科技学院，河北秦皇岛 066004)

小麦是全球分布范围最广的粮食作物，其产量和种植面积均居世界谷物的首位[1]。小麦产量与其生长状况有关，其生长过程中易受到多种病害的危害，导致产量降低或品质变差，其中土传病害尤为严重[2]。麦根腐平脐孺孢(Bipolarissorokiniana)是一种能够侵染小麦的重要土传病原菌，该病菌引发的病害在小麦整个生育期均可发生，通常表现为种子发芽率低、根腐病、茎基腐病、叶斑病和穗腐病等症状，导致小麦大幅减产，严重时减产超过50%[3-6]。小麦根腐病在中国北部地区比较普遍，近年来在广东、福建等小麦种植区也有发现，对小麦安全生产造成严重威胁[7]。

目前，小麦根腐病的防治主要以化学药剂处理种子为主，以农田作物轮作、筛选抗病品种、生物防治等为辅[8]。化学药剂处理种子能够有效降低病害发生几率，但长期不合理使用不仅导致病原菌对药剂产生抗性，破坏土壤微生物群落平衡，也造成了环境污染[9-10]。农田作物轮作与种植区域有关，利用水旱轮作可有效降低土壤中有害病原菌的存活率[11-12]。利用抗病品种防治小麦根腐病，经济安全，但选育工作时间不仅长，而且在种植过程中植株的抗病能力普遍较差[13-14]。生物防治对于降低病菌数量、恢复土壤健康有重要实践意义，但土壤自然环境多变，病菌种类多样，生防微生物定殖能力差，且生防菌具有定向性，难以大规模使用[15-16]。因而，小麦根腐病防治仍是一个亟待解决的难题。

近几年，随着纳米技术的发展，纳米抗菌材料应运而生。与传统化学药剂相比，纳米材料具有安全、高效、广谱、不易产生抗药性等特点，已成为当前领域的研究热点。已有研究表明，纳米银对多种细菌、真菌和支原体具有强烈的抑制作用，是一种良好的无机抗菌材料[17]。Mishra等[18]采用生物法合成的纳米银粒子能够抑制小麦叶片上小麦根腐菌分生孢子的萌发，降低小麦植株感染叶斑病的几率。Mishra和Singh[19]研究发现，纳米银在低浓度时显著抑制小麦根腐菌菌丝的生长。李琴琴等[20]采用化学还原法制备的纳米银能够破坏小麦赤霉病菌完整性，抑制病菌生长。Ali等[21]采用苦艾水提取物合成纳米银材料对引发植物病害的六种寄生疫霉菌具有抗疫能力，能够提高植物存活率。2016年陈娟妮等[22]采用静电自组装法合成石墨烯-纳米银材料，4.68 μg·mL-1的浓度就能够抑制禾谷镰刀菌分生孢子萌发，抑制离体叶片上病斑的发展。这些研究结果表明，纳米银对植物病原菌分生孢子萌发和菌丝生长具有显著抑制作用，但是关于纳米银对病菌侵染下植物生长影响的研究尚不多见。

本研究以杨树叶为生物模板制备纳米ZnO-Ag复合材料，探究ZnO-Ag对根腐病菌菌杀菌活性，通过盆栽试验，在土壤接种小麦根腐菌情况下，测定纳米ZnO-Ag复合材料对小麦种子萌发和幼苗生长的影响，旨在为小麦根腐病的田间防治提供参考，为ZnO-Ag的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株和培养基

本研究所用麦根腐离孺孢菌(B.sorokiniana)，由中国农业科学院作物科学研究所作物遗传育种中心提供。PDA固体培养基：称取马铃薯200 g，洗净去皮切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，趁热过滤后加入葡萄糖20 g，琼脂20 g，定容至1 000 mL，121 ℃灭菌30 min，备用。

1.1.2 供试小麦和土壤

供试的京东8号小麦由河北科技师范学院植物生理与生物技术实验室提供。播种前种子用3% H2O2浸泡10 min，无菌水清洗3次。将种子浸泡于无菌水中，12 h后选取颗粒饱满种子，备用。供试土壤取自河北科技师范学院试验田，土壤置于高压蒸汽灭菌锅中121 ℃，灭菌1 h，杀灭可能存在的微生物和孢子，晾干备用。重复3次，盆钵为塑料盆，上口内径9 cm，盆底内径 7 cm，高7.5 cm，于高压蒸汽灭菌锅中121 ℃，灭菌15 min，备用。

1.2 方 法

1.2.1 纳米ZnO-Ag复合材料的制备

采用生物模板法合成纳米材料。以杨树叶片为模板，将新鲜的杨树叶片用去离子水清洗干净，置于2%(v/v)戊二醛溶液中固定6 h。用去离子水清洗后，将叶片浸泡于2%( v/v)的盐酸溶液中，12 h后去离子水清洗。将叶片置于100 mL溶有Zn(NO3)2(0.08 M)和AgNO3(0.06 M)的溶液中，60 ℃保温72 h。将叶片水洗风干，置于马弗炉中500 ℃煅烧2 h，研碎即得。利用X-射线衍射(X-ray diffraction，XRD)和透射电子显微镜(transmission electron microscopy，TEM)对材料成分和形貌进行分析。

1.2.2 小麦根腐菌的活化与培养

将保藏的小麦根腐菌菌液涂布于PDA固体培养基上，28 ℃培养4～5 d，用打孔器取直径为 6 mm的菌饼转接于新的PDA固体培养基中， 28 ℃培养，待菌丝铺满平板后置于4 ℃冰箱保存，备用。

1.2.3 纳米ZnO-Ag复合材料对小麦根腐菌菌丝抑制效果的测定

采用菌丝生长速率法测定。具体步骤：无菌条件下，用灭菌的PAD培养基稀释纳米ZnO-Ag复合材料，终浓度分别为12.5、25、50、100、200 μg·mL-1，以不加ZnO-Ag材料的培养基为对照。取生长一致直径为6 mm的小麦根腐菌菌饼接种至上述平板中心，28 ℃静置培养，每个处理重复3次。待对照菌落铺满平板时停止培养，沿平板直径十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。菌丝生长抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-0.6 cm)

1.2.4 纳米ZnO-Ag复合材料对小麦根腐病菌侵染下小麦幼苗生长效应的测定

盆栽试验参考张姗姗等[23]研究方法，于2019年3月中旬在河北科技师范学院植物生理与生物技术实验室实施。灭菌后盆钵中装入供试土壤，每盆500 g。纳米ZnO-Ag复合材料用无菌水稀释，超声处理30 min。每盆分次加入50 mL不同浓度的ZnO-Ag复合材料溶液，使土壤中材料终浓度分别为12.5、25、50、100、200 μg·g-1，每个浓度5次重复，对照加入50 mL无菌水。将直径为6 mm的小麦根腐菌饼分成4份均匀埋入土中，约5 cm深，28 ℃培养1周使病菌充分生长。之后每盆均匀播种小麦12粒，约3 cm深，于培养箱中培养。光周期设置为白天14 h、22 ℃，夜晚10 h、18 ℃，相对湿度80%。每天使用无菌水灌溉，维持小麦正常生长。

1.2.5 测定项目

小麦播种后第3天测定发芽势，7 d测定发芽率。播种21 d后，将盆中所有幼苗连根拔出，洗净，测定幼苗发病率，幼苗发病数是幼苗根部变褐、腐烂死亡的幼苗数和未萌发种子数之和。将幼苗以子叶着生部位为准分开地上、地下部分，分别测量根长和株高，称量鲜重后置于烘箱中85 ℃烘干至恒重，并计算根冠比。

发芽势=前3 d发芽种子总数/供试种子粒数×100%

发芽率=7 d发芽种子粒数/供试种子粒 数×100%

幼苗发病率=(未萌发种子数+发病幼苗数)/供试种子数×100%

根冠比=地下部分干重/地上部分干重

1.3 数据处理

采用Excel 2017进行数据整理和绘图，采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析和LSD显著性检验(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 纳米ZnO-Ag复合材料的表征

利用生物模板法制得的纳米ZnO-Ag复合材料呈黑色细粉状。XRD分析图谱(图1A)显示为尖锐峰，表示材料的结晶度较好。图1A标注*的为ZnO衍射峰，2θ值在31.68°、34.32°、 36.16°、47.44°、56.50°、62.76°和67.86°处，与标准卡(JCPDS No.36-1451)[24]上(100)、(002)、(101)、(102)、(110)、(103)和(112)晶面所对应的2θ值基本一致。图1A标注#的光谱2θ值，从小到大依次对应Ag的四个晶面(111)、(200)、(220)和(311)，这与Ag的标准图谱卡片(JCPDS No.04-0783)相吻合[25]。TEM结果(图1B)表明，该材料为近圆形的纳米层状结构，平均颗粒直径为30～50 nm。高分辨透射电子显微成像(high-resolution transmission electron microscopy，HRTEM)结果表明，晶格间距为0.26 nm对应ZnO的(002)晶面[26]，晶格间距为0.23 nm对应Ag的(111)晶面[27]，由此可进一步确定，本材料为ZnO与Ag的复合体。

图1 纳米ZnO-Ag复合材料的XRD衍射花样(A)、TEM图(B)和HRTEM图(C)Fig.1 XRD patterns(A), TEM image(B) and HRTEM image(C) of ZnO-Ag nanocomposites

2.2 纳米ZnO-Ag复合材料的抑菌效果

由表1可知，纳米ZnO-Ag复合材料能够抑制小麦根腐菌菌丝的生长，菌丝生长抑制率随材料浓度的升高而增大，200 μg·mL-1ZnO-Ag对病菌菌丝生长抑制率高达91.17%；不同浓度复合材料处理的病菌菌丝生长抑制率间差异均显著(P<0.05)。纳米ZnO-Ag对病菌的毒力回归方程为y=2.581 8+1.577 1x，EC50=34.15 μg·mL-1，说明ZnO-Ag复合材料对小麦根腐病菌的抑制作用较强。

表1 纳米ZnO-Ag复合材料对小麦根腐菌菌丝生长影响Table 1 Effect of ZnO-Ag nanocomposites on growth of Biploaris sorokiniana

2.3 纳米ZnO-Ag复合材料对根腐病菌侵染下小麦种子萌发的影响

由表2可知，随着土壤中纳米ZnO-Ag复合材料浓度增加，小麦种子的发芽势和发芽率均逐渐升高。 12.5 μg·g-1ZnO-Ag处理的小麦种子发芽势与对照无显著差异，其他浓度处理组发芽势显著升高(P<0.05)。200 μg·g-1ZnO-Ag处理的小麦种子发芽势显著高于12.5、25、 50 μg·g-1处理组，与100 μg·g-1处理组无显著差异，而ZnO-Ag浓度为25、50、100 μg·g-1处理间小麦种子发芽势无显著差异。不同浓度ZnO-Ag处理的小麦种子发芽率均显著高于对照。12.5 μg·g-1ZnO-Ag处理的小麦发芽率显著低于其他浓度处理，浓度为25、50、100、200 μg·g-1处理间发芽率无显著差异。

表2 纳米ZnO-Ag复合材料处理对小麦种子萌发的影响Table 2 Effect of ZnO-Ag nanocomposites on germination of wheat seeds %

2.4 纳米ZnO-Ag复合材料对根腐病菌侵染下小麦幼苗生长的影响

2.4.1 对小麦幼苗根长和株高的影响

由图2A、图2B可知，ZnO-Ag复合材料处理的小麦幼苗根长和株高均显著高于对照(P< 0.05)。由图2A可知，经50 μg·g-1ZnO-Ag处理的小麦幼苗根长最长，平均为9.88 cm，显著高于其他处理；ZnO-Ag浓度为25、100 、200 μg·g-1处理的小麦幼苗根长显著高于12.5 μg·g-1处理，前三个浓度处理间无显著差异(P<0.05)。由图2B可知，50μg·g-1ZnO-Ag处理的小麦幼苗株高最高，平均为20.13 cm，显著高于12.5、25 μg·g-1处理组，与100、200 μg·g-1浓度处理组无显著差异(P<0.05)。

图柱上不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。Different letters above columns mean significant difference among treatment at 0.05 level. The same in figures 3-6.图2 纳米ZnO-Ag复合材料对小麦根长和株高的影响Fig.2 Effect of ZnO-Ag nanocomposites on the length of wheat root and the height of wheat seedlings

由图3可知，随着土壤中纳米ZnO-Ag复合材料浓度的升高，小麦根长/株高逐渐降低。12.5 μg·g-1ZnO-Ag处理的小麦幼苗根长/株高与对照间无显著差异，其他浓度处理显著低于对照组(P<0.05)。浓度为25、50、100、200 μg·g-1ZnO-Ag处理的小麦幼苗的根长/株高较对照组分别降低了18.9%、18.3%、21.6%和24.8%，各浓度处理间无显著差异(P<0.05)。

图3 纳米ZnO-Ag复合材料对小麦根长/株高的影响Fig.3 Effect of ZnO-Ag nanocomposites on the ratio of wheat root length and seedling height

2.4.2 对小麦幼苗鲜重和干重的影响

由图4A、4C可知，随着土壤中纳米ZnO-Ag复合材料浓度的升高，小麦幼苗地下部鲜重、干重呈上升趋势，且均显著高于对照处理(P<0.05)。200 μg·g-1ZnO-Ag处理的小麦幼苗地下部鲜重、干重均显著高于其他浓度处理组，较对照组分别升高8.93和8.37倍；ZnO-Ag浓度为50和100 μg·g-1处理间小麦幼苗地下部鲜重、干重均无显著差异(P<0.05)。由图4B、4D可知，不同浓度纳米ZnO-Ag复合材料处理的小麦幼苗地上部鲜重、干重均显著高于对照组，12.5、25、50、100、200 μg·g-1ZnO-Ag处理的小麦幼苗地上部鲜重较对照组分别升高2.47、8.39、24.90、23.15和29.62倍，干重较对照组分别升高2.16、4.14、7.22、 7.36和9.05倍。ZnO-Ag浓度为50和100 μg·g-1处理间小麦幼苗地上部鲜重、干重均无显著差异，其他浓度处理间差异显著 (P<0.05，图4B、4D)。

图4 纳米纳米ZnO-Ag复合材料对小麦幼苗地下部和地上部鲜重、干重的影响Fig.4 Effect of ZnO-Ag nanocomposites on the weight of wheat root and shoot

2.4.3 对小麦幼苗根冠比的影响

由图5可知，与对照相比，土壤中添加浓度为12.5 μg·g-1ZnO-Ag复合材料处理的小麦幼苗根冠比显著升高，而25、50、100、200 μg·g-1ZnO-Ag处理组显著降低(P<0.05)。12.5 μg·g-1ZnO-Ag处理的小麦幼苗根冠比为 1.35，较对照组升高28.6%，其他浓度为ZnO-Ag处理的小麦幼苗根冠比都低于1.0，且各浓度处理间无显著差异(P<0.05)。

图5 纳米ZnO-Ag复合材料对小麦根冠比的影响Fig.5 Effect of ZnO-Ag nanocomposites on the root-shoot ratio of wheat

2.5 纳米ZnO-Ag复合材料对根腐病菌侵染下小麦幼苗发病率的影响

由图6可知，随ZnO-Ag复合材料浓度的增加小麦幼苗发病率逐渐下降。12.5μg·g-1材料处理的小麦幼苗发病率与对照组相比无显著差异(P<0.05)，而25、50、100、200 μg·g-1ZnO-Ag处理组均显著降低，较对照组分别降低了 16.67%、40.00%、46.67%和48.33%。25 μg·g-1ZnO-Ag处理的小麦幼苗发病率显著高于50、100、200 μg·g-1材料处理组，ZnO-Ag浓度为50、100、200 μg·mL-1处理间无显著差异(P<0.05)。

图6 纳米ZnO-Ag复合材料对小麦幼苗发病率的影响Fig.6 Effect of ZnO-Ag nanocomposites on the incidence of wheat seedling

3 讨 论

由于病原菌的变异和对化学药剂的抗性，使得农业生产上化学药剂的施用浓度越来越高，导致植物病原菌对杀菌剂的抗性越来越强[28]。长期下去，这种连锁效应会越来越厉害，严重威胁农作物的生产。近几年国内外研究者将纳米技术应用在植物病害防控上，为有效解决农作物病害开辟了新途径[29]。

本研究发现，纳米ZnO-Ag复合材料能显著抑制小麦根腐菌菌丝的生长，抑制作用呈现剂量效应。200 μg·mL-1ZnO-Ag复合材料对根腐病菌菌丝生长抑制率达91.17%，EC50为34.15 μg·mL-1。Mishra等[18]采用生物法合成的纳米银浓度为10 μg·mL-1时，可抑制小麦根腐菌分生孢子的萌发；0.05 mg·mL-1的纳米银显著抑制病菌菌丝生长，浓度为0.1 mg·mL-1时完全抑制病菌菌丝生长[19]。李琴琴等[20]制备的纳米银浓度为10 μg·mL-1时，对小麦赤霉病菌菌丝生长抑制率达90%。王虎军等[30]发现，0.8 mg·mL-1纳米ZnO对甜瓜致病菌粉红单端孢、镰刀菌菌丝生长抑制率分别为77.8%和74.3%，当ZnO浓度为2.4 mg·mL-1时，对交链孢菌丝生长抑制率为76.7%。Yehia和Ahmed[31]研究发现，粒径为70±15 nm的ZnO纳米粒子浓度12 mg·L-1时，对尖孢镰刀菌和扩展青霉菌的菌丝生长抑制率分别达到77%和100%。因此，在植物病害防治方面，ZnO纳米粒子和银纳米粒子显示出良好的抗菌性能，可为植物病害防控提供新方法。

种子萌发和幼苗生长阶段是植物感知外界环境变化的敏感阶段，其生长状态直接影响植物后续的生长和发育。根腐病的发生不仅能够降低小麦种子发芽率、影响小麦幼苗生长，而且严重影响小麦的产量和品质[32]。本研究结果表明，在土壤接种小麦根腐病菌情况下，向土壤中加入ZnO-Ag复合材料，小麦种子的发芽势和发芽率、小麦幼苗的根长、株高、地上部鲜重和干重、地下部鲜重和干重与对照组相比均有不同程度升高，小麦幼苗发病率降低，这与小麦受土传病害侵染时采用生防菌处理对小麦幼苗影响一致[33-34]。本研究结果说明，纳米ZnO-Ag复合材料能够抑制土壤中小麦根腐病菌生长，促进小麦种子萌发和幼苗生长，降低小麦幼苗发病率。

根系是植物吸收营养物质的主要组织，土壤中营养物质的可利用度取决于植物所处的环境。植物的根长和株高可以反应植物生长情况及适应外界环境能力，其比值是植物同化资源分配的一种表现[35]。在逆境环境下(如干旱胁迫)，植物为维持生存根系生长加快，根生物量和长度大，根冠比高[36]。本研究结果表明，土壤接种根腐病菌情况下，随着纳米ZnO-Ag复合材料浓度的增加，小麦幼苗根长/株高逐渐降低。这可能是在根腐病菌侵染下，对照组小麦通过增加根的生长量抵御病菌伤害，而处理组中ZnO-Ag抑制了病菌生长，病菌对根生长抑制作用减弱，因而根长/株高降低。小麦幼苗根冠比随着土壤中ZnO-Ag处理浓度的升高呈先升高后降低趋势，这可能是病菌侵染下，小麦幼苗地上部和地下部生长都受到抑制；12.5 μg·g-1ZnO-Ag处理根冠比最高，说明此环境严重抑制小麦地上部分的生长，这可能是低浓度ZnO-Ag对病菌抑制作用较差，植物通过增加根的干生物量来抵御病害，高于此浓度，ZnO-Ag对病菌抑制作用增强，病菌对植物根生长影响减小，由此生物量倾向于向地上分配，以利于植株获取地上资源，保证植物适应逆境环境。这与他人研究植物在逆境中生长，外源调节对植物生长的影响结果一致[36-37]。

近年来，由于小麦栽培模式单一化、田间管理不善、缺乏抗病品种和播种者防病意识差等原因导致小麦根腐病害越来越严重，传统的方法已远远不能有效防治植物病害[8]，纳米抗菌技术的发展为植物病害防控注入了新活力，在植物病害防控方面发挥了积极作用[29]。本研究中制备的纳米ZnO-Ag复合材料能有效抑制小麦根腐病菌生长，在小麦受到病菌侵染时，能够通过抑制病菌菌丝生长，促进小麦种子萌发和幼苗生长，降低小麦幼苗发病率，由此证明该复合材料可用于小麦根腐病害防治。纳米银粒子一般通过释放银离子破坏细菌的细胞壁和细胞膜，或者直接接触菌体使菌体内产生大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)等机制杀菌或抑制菌体生长[38]，但是该复合材料如何抑制小麦根腐病菌菌丝的生长尚不清楚。另外纳米银粒子在自然界中释放对植物生长的影响，以及是否会造成生态环境污染还需进一步研究。