一种呋喃西林酶联免疫检测方法的建立

李泳宁 彭臻菲 黄慧 蔡美虹 林清清

摘要[目的]建立一种饲料中呋喃西林酶联免疫检测方法。[方法]利用制备的人工抗原和高特异性单克隆抗体，采用间接竞争酶联免疫技术建立呋喃西林检测方法。[结果]在优化条件下，检测抗原浓度为10 μg/mL，抗体稀释度为1∶5 000。呋喃西林在0.1～10.0 ng/mL具有较好的线性关系（R2=0.998 7），IC50为1.43 ng/mL。与呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林代谢物氨基脲的交叉反应率低于0.5%。饲料样品中添加呋喃西林的平均回收率为87.5%～96.0%，变异系数为6.1%～9.7%。[结论]该方法快速、准确、灵敏，可用于饲料中呋喃西林的分析检测。

关键词呋喃西林;酶联免疫检测;单克隆抗体;饲料

中图分类号R446.6文献标识码A

文章编号0517-6611（2020）04-0193-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.056

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Establishment of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Determination of Nitrofurazone

LI Yong-ning，PENG Zhen-fei，HUANG Hui et al（Fujian Health College，Fuzhou，Fujian 350101）

Abstract[Objective]To establish an enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） for the determination of nitrofurazone in feed.[Method]The artificial antigen and the high specificity monoclonal antibodies against nitrofurazone were prepared.An indirect competitive ELISA for the determination of nitrofurazone in feed was established.[Result]The optimization of ELISA parameters were that the concentration of antigen was 10 μg/mL and the dilution multiples of antibodies was 1∶5 000.The good linear range was 0.1-10.0 ng/mL（R2=0.998 7） and IC50 was 1.43 ng/mL.The cross-reactivity （CR） rate was less than 0.5% with other nitrofurans such as furazolidone，furaltadone，furantoin and semicarbazide.The average recovery from artificially contaminated nitrofurazone of feed was 87.5%-96.0%，with coefficient of variation （CV） was 6.1%-9.7%.[Conclusion]The method developed is rapid，accurate and sensitive and will be helpful for rapid screening for nitrofurazone in feed.

Key wordsNitrofurazone;Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）;Monoclonal antibody;Feed

硝基呋喃类药物是一类具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药物，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、某些真菌和原虫均有作用[1]。呋喃西林是硝基呋喃类代表药物之一，具有杀菌能力强、抗菌谱广和价格低廉等优点，曾被广泛使用在养殖业中。但越来越多的研究表明，硝基呋喃类药物及其代谢产物具有一定的毒性作用，可诱发癌症[2]，尤其是呋喃西林代谢物氨基脲对人体有致癌、致畸胎等副作用[3]。因此，越来越多的国家严禁使用呋喃西林药物，而2002年我国农业部193号公告也禁止使用硝基呋喃类药物在食用动物上。但是由于呋喃西林使用效果明显、价格便宜，目前仍然存在违规用药情况。因此，对呋喃西林的检测显得尤为重要。

目前，呋喃西林的方法主要有高效液相色谱法[4-5]和液相色谱-质谱联用法[6-7]。其中，高效液相色谱法可靠性较强且重复性好，广泛应用于饲料以及动物食品中的残留检测，最低检出限可达1 μg/kg;液相色谱-质谱联用法具有高灵敏度、高选择性的特点，最低检出限可达0.50 μg/kg，但仪器设备要求高，检测费用成本昂贵。近年来快速发展的免疫检测法具有检测速度快、灵敏度高和选择性强等优点，广泛应用于各类药物残留的检测中，也是目前检测的重要方向。由于呋喃西林在动物体内代谢迅速，而其代谢物可在机体内稳定存在，一般采用检测呋喃西林代谢物来判定食用动物中是否存在药物残留，而对呋喃西林的免疫学检测方法则报道较少。该研究利用合成的人工抗原和高特异性抗呋喃西林单克隆抗体建立呋喃西林免疫检测方法，并进行饲料中呋喃西林的检测方法研究，可望用于饲料样品的大量筛查。

1材料与方法

1.1材料与仪器呋喃西林（nitrofurazone，NFZ）、呋喃唑酮和呋喃妥因购自东京化成工业株式会社;呋喃它酮和呋喃西林代谢物氨基脲购于德国Dr.Ehrenstorfer公司;卵清蛋白（ovalbumin，OVA）为Worthington公司产品;四甲基联苯胺（3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB）为TIANGEN公司产品;HRP标记羊抗小鼠IgG购自北京庄盟公司。其他试剂均为分析纯。NFZ-OVA人工抗原和抗呋喃西林單克隆抗体由福建卫生职业技术学院生物医药工程中心制备。SpectraMax M3型多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司。

该研究利用制备的抗呋喃西林高特异性单克隆抗体，采用间接竞争酶联免疫技术建立呋喃西林检测方法。结果表明，呋喃西林在0.1～10.0 ng/mL具有较好的线性关系（R2=0.998 7），IC50为1.43 ng/mL。与呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林代谢物氨基脲的交叉反应率均低于0.5%。饲料样品中添加3个浓度呋喃西林的回收率为87.5%～96.0%， CV值为6.1%～9.7%。可见该方法快速、准确、灵敏，可用于饲料中呋喃西林的分析检测。

参考文献

[1]

梁娟，于盟盟，韩梅，等.ELISA法检测水产品中硝基呋喃代谢物残留见解[J].河北渔业，2014（4）：45-47.

[2] 王玉堂.禁用漁药——硝基呋喃类药物的毒性及危害[J].中国水产，2017（4）：85-86.

[3] 李斌.呋喃西林代谢物SEM单克隆抗体的制备及其荧光定量检测试纸条的研究[D].广州：华南理工大学，2018.

[4] 温丽媛，莫宝福，李冰，等.HPLC法检测饲料中四种硝基呋喃类药物的研究[J].轻工科技，2018（4）：104-106.

[5] 黄帆，屈晓铃，周苏，等.高效液相色谱法测定饲料中硝基呋喃类药物[J].现代食品，2017（5）：91-92.

[6] 邢丽红，李兆新，孙伟红，等.液相色谱-串联质谱法检测水产品中硝基呋喃类药物的残留量[J].食品安全质量检测学报，2017，8（4）：1233-1239.

[7] 吴剑平，张婧，李丹妮，等.液相色谱串联质谱法正负模式切换同时检测饲料中10种硝基呋喃类化合物[J].中国兽药杂志，2017，51（11）：51-58.

[8] 吴旭，卜媛媛.HPLC-MS/MS法测定2017-2018年淮安地区小龙虾中硝基呋喃类代谢物残留量[J].中西医结合心血管病杂志，2018，6（24）：197-198.

[9] 张桂芳，张晓瑜，王志昱，等.烟台市养殖虾中19种抗生素残留监测结果分析[J].现代预防医学，2018，45（8）：1398-1400，1404.

[10] 陈宗保，刘林海，尹月春，等.改性纳米金富集-毛细管电泳法测定水产品中硝基呋喃类药物残留[J].分析试验室，2018，37（7）：760-764.

[11] 许月明，潘言方，李慧慧.ELISA可视化微阵列芯片法检测蜂蜜中硝基呋喃类药物的残留量[J].食品安全导刊，2018（18）：147-150.

[12] 梁高道，毛翔，黄常刚，等.全自动磁微粒化学发光法快速筛查呋喃类药物残留[J].环境科学与技术，2019，42（1）：178-183.