基于气相色谱-质谱联用技术的血清氨基酸代谢谱在尿石症中的应用

高 瑶, 龚思思, 张天闻, 唐敏洁, 张蓓英, 陈 敏, 欧启水, 毛厚平

(1. 福建医科大学医学技术与工程学院, 福建 福州 350004; 2. 福建省渔业资源监测中心, 福建 福州 350003; 3. 福建医科大学附属第一医院, 福建 福州 350005)

尿石症是泌尿外科最常见的疾病之一,5年复发率超过50%,发病机制尚不明确[1]。我国是世界上三大结石高发区之一,尿石症发病率约为6%[2]。目前,诊断尿石症常需借助计算机断层扫描(CT)和超声波,辅助血清生化试验和尿液分析等手段[3,4]。这些方法价格昂贵,不仅无法实现早期诊断,而且具有一定辐射性或侵入性,患者常因缺乏早期预防和充分护理而受累[5]。因此,发展一种简便快捷的早期诊断尿石症的方法尤为重要。

氨基酸是人体重要的营养物质[6],与氨基酸相关的各类代谢物约占人体重量的20%,在调控各项代谢通路中发挥重要作用[7]。氨基酸代谢谱作为代谢组学研究策略之一,近年来已应用于乳腺癌、食管癌、帕金森病及主动脉夹层分离等研究中[7-10]。Atanassova等[11]采用高效液相色谱法分析36例结石患者尿氨基酸排泄情况,发现约50%患者尿液中含有较低的丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、牛磺酸和亮氨酸(Leu)。Zee等[12]和Sahota等[13]利用基因敲除的Slc3a1(-/-)小鼠胱氨酸(CySS)尿症模型均证实CySS与CySS结石的形成密切相关。Gao等[14]建立小鼠草酸钙结晶沉积肾脏模型,发现了包括精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、脯氨酸(Pro)和色氨酸(Try)在内的30种代谢物可作为结晶性肾损害的潜在生物标志物。这些报道表明,尿石症患者体内可能存在氨基酸代谢紊乱现象,有望通过氨基酸代谢谱筛查出标志物,揭示结石形成机制。

氨基酸是两性离子,其羧基、氨基以及侧链官能团未衍生化前并不适合进行色谱分离,酯化、酰化、硅烷化等衍生法可增强其在色谱柱上的保留,提高分析灵敏度[15]。相较于氯甲酸异丁酯(IBCF)等酯化衍生试剂,四甲基硅烷(TMS)等硅烷化衍生试剂对水分子敏感性强[16],不适用于血清、尿液等含水量高的生物样本。液相色谱荧光法和紫外分光光度法常存在干扰物共洗脱的问题[17],而气相色谱-质谱法(GC-MS)具有高灵敏度、高选择性和高通量等优势,在糖尿病、心肌梗死与类风湿关节炎等疾病研究中已有相关报道[18-20],且在寻找潜在生物标志物时,常用于检测氨基酸、脂肪酸与花生四烯酸等天然物质[21-24]。

目前尚无尿石症相关氨基酸代谢谱的研究报道,且探讨患者体内氨基酸代谢异常与疾病相关性的分析仍较少。血清样本具有方便易取和稳定通用的优势,是用于筛检生物标志物的理想样本[25-27]。因此,本研究拟运用GC-MS建立尿石症的血清氨基酸代谢谱,从中筛选特征性差异氨基酸作为潜在生物标志物,为早期诊断尿石症提供新思路。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

7890B-5977A气相色谱-质谱仪、2 mL样品瓶(美国Agilent公司); 1.5 mL离心管(美国Corning公司);超纯水仪(德国Millipore公司); 3-30K高速离心机(德国Sigma公司); BP 211 D电子天平(德国Sartorious公司)。

17种氨基酸混合标准品包括丙氨酸(Ala)、Arg、天冬氨酸(Asp)、CySS、谷氨酸(Glu)、Leu、赖氨酸(Lys)、Ser、苏氨酸(Thr)、Tyr、缬氨酸(Val)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、蛋氨酸(Met)、Gly、苯丙氨酸(Phe)和Pro(美国Sigma-Aldrich公司),其中CySS浓度为1 250 μmol/L,其余氨基酸浓度均为2 500 μmol/L;单氨基酸标准品包括Try(纯度98.5%)、半胱氨酸(Cys,纯度98%)和谷氨酰胺(Gln,纯度99%)(加拿大Toronto Research Chemicals公司);乙腈、无水乙醇、异辛烷(色谱纯,德国Merck公司);氢氧化钠、氯苯丙氨酸(CPA,分析纯)、盐酸(优级纯)(国药集团有限公司);吡啶(纯度99.8%,中国上海阿拉丁公司); IBCF(分析纯,中国上海安谱公司)。

1.2 实验方法

1.2.1样本收集

研究对象为2015～2016年福建医科大学附属第一医院泌尿外科80例尿石症患者(病例组)和同期体检中心37例健康体检者(对照组),两组年龄与性别无统计学差异(p>0.05)。所有研究对象均清晨空腹肘前静脉采血于分离胶促凝管,并于采集后1 h内以3 000 r/min离心10 min,取上层血清分装入1.5 mL离心管中,于-80 ℃冰冻保存。研究所涉及血清样本均经福建医科大学伦理委员会审定([2014]福医伦理审字第(106)号)。

1.2.2标准溶液配制

分别准确称取适量Try、Cys和Gln,各加入0.1 mol/L盐酸,配制成浓度为2 000 μmol/L的标准储备液。

用0.1 mol/L盐酸作为溶剂,将上述标准储备液与17种氨基酸混合标准品配制成500 μmol/L混合标准溶液(CySS浓度为250 μmol/L);再用0.1 mol/L盐酸稀释成1、5、10、25、50、100和250 μmol/L(CySS对应浓度为0.5、2.5、5、12.5、25、50和125 μmol/L)的系列混合标准溶液,于4 ℃保存。

1.2.3样本前处理

血清样本于室温复融后，以3 000 r/min离心5 min,吸取100 μL,置于1.5 mL离心管中,加入400 μL乙腈和200 μL乙醇,摇匀,于4 ℃静置20 min,以3 000 r/min离心5 min。吸取500 μL上清液,置于2 mL样品瓶中,依次加入100 μL 0.1 mg/mL CPA、400 μL超纯水和10 μL 7 mol/L氢氧化钠后,吹打混匀1 min,加入50 μL吡啶后,振荡混匀1 min,加入40 μL IBCF后,混匀1 min,并在反应过程中注意放气,然后加入300 μL异辛烷,混匀后静置5 min,吸取上清液100 μL,置于2 mL样品瓶中,待GC-MS分析。

1.2.4分析条件

色谱柱:HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美国Agilent公司);进样口温度:260 ℃;不分流进样;载气:高纯氦气(99.999%);流速:1 mL/min。升温程序:初始温度80 ℃,保持2 min,以10 ℃/min的速率升至140 ℃,再以4 ℃/min的速率升至240 ℃,然后以10 ℃/min的速率升至280 ℃,保持3 min。进样量:1 μL。

离子源:电子轰击(EI)源;扫描模式:选择离子监测(SIM)模式;电子碰撞能量:70 eV;传输线、离子源和四极杆温度:260、230和150 ℃;溶剂延迟时间:9.5 min。

1.2.5统计学分析

多元统计学分析:117例临床血清样本的氨基酸含量数据采用SIMCA-P 14.1软件进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA),用于考察病例组和对照组之间氨基酸代谢谱的差异。PCA是一种无监督的多元变量分析,以观测所有样本间的分离趋势并剔除离群值。OPLS-DA是一种有监督多元统计分析方法,用Pareto量化处理两组氨基酸代谢谱后,可清晰直观地观察两组间的分离趋势,并通过设置变量重要性投影(VIP)阈值,筛选出差异氨基酸,同时利用模型交叉验证预测力Q2值和盲样预测散点图展示模型的预测能力。

潜在生物标志物确定:采用SPSS 17.0软件进行两样本t检验分析,设置p界值为0.05,结合OPLS模型VIP阈值为1,筛选具有统计学意义的差异氨基酸。同时,运用逻辑回归分析和受试者工作特征(ROC)曲线评价潜在生物标志物的临床诊断能力。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件优化

本研究优化了血清前处理方法。首先,采用不同组合和比例的甲醇、乙醇和乙腈作为蛋白质沉淀剂进行正交实验。结果表明，体积比为2∶1的乙腈-乙醇混合溶液对血清蛋白的沉淀效率最高。接着,考察了三氟乙酸酐、氯甲酸乙酯、氯甲酸丙酯和IBCF等衍生试剂,结果显示,当IBCF作为衍生化试剂时,反应时间较短且产物稳定。最后,分别比较了氯仿、正己烷和异辛烷等萃取剂对酯化氨基酸的提取能力,结果表明异辛烷的萃取效率较高。

图1 16种目标氨基酸和内标CPA的总离子流(TIC)色谱图Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatogram of the 16 target amino acids and CPA (IS) CPA: chlorphenylalanine; Ala: alanine; Gly: glycine; CySS: cystine; Val: valine; Leu: leucine; Ile: isoleucine; Pro: proline; Ser: serine; Asp: aspartic acid; Met: methionine; Cys: cysteine; Glu: glutamate; Phe: phenylalanine; Lys: lysine; Try: tryptophan; Tyr: tyrosine.

2.2 目标氨基酸定性结果

吸取100 μL 50 μmol/L氨基酸混合标准溶液(CySS的浓度为25 μmol/L),按1.2.3节血清前处理方法经沉淀、衍生化和萃取,进入GC-MS检测。优化色谱分离条件与质谱检测条件后,发现其中4种氨基酸衍生效果不理想,为保证定量准确,故将目标氨基酸确定为Ala、Gly、CySS、Val、Leu、Ile、Pro、Ser、Asp、Met、Cys、Glu、Phe、Lys、Try和Tyr,共16种。

图1为50 μmol/L氨基酸混合标准品溶液(CySS的浓度为25 μmol/L)和内标CPA的总离子流(TIC)色谱图,可见目标氨基酸达到了较好的分离效果;其中,通过特征质谱图(见图2)确定了各氨基酸的特征碎片峰,结合保留时间进行定性分析,在SIM模式下进行定量。

表 1 16种目标氨基酸的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限

Y: peak area ratio of amino acid to internal standard;X: concentration, μmol/L.

2.3 方法学考察

按1.2.2节配制系列混合标准溶液,经衍生化后进行GC-MS检测,以目标氨基酸定量离子与内标物CPA定量离子的峰面积比值为纵坐标(Y)、目标氨基酸的浓度为横坐标(X, μmol/L)绘制标准工作曲线。结果表明,16种氨基酸在各自范围内线性关系良好,相关系数(R2)均超过0.998 5。以信噪比(S/N)为3和10时分别对应的标准品浓度确定方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ),目标氨基酸的LOD和LOQ分别为0.1～4.0 μmol/L和0.3～13.2 μmol/L。16种目标氨基酸的线性范围、回归方程、相关系数、LOD和LOQ见表1。

2.4 模式识别分析

根据方法学考察结果可知,大部分样本中CySS和Cys浓度均低于其LOD值。因此,针对其余14种目标氨基酸进行多元统计学分析。PCA为无监督模式识别方法,能够观察各样本间分布情况,以R2X表示该模型相应主成分对整体变量的解释能力。如图3a所示,PCA模型参数R2X值为0.747,说明主成分的累积贡献率达到74.7%。为进一步降低组内差异的干扰,分析氨基酸代谢谱的诊断价值,构建了有监督状态下的OPLS-DA模型(见图3b),两组样本有了进一步较明显的分离。模型参数为R2X=0.501、R2Y=0.475和Q2=0.402。为进一步说明模型的预测能力,在两组中分别随机抽取20%的样本作为盲样,进行OPLS-DA模型分析。图3c展示了该模型较高的预测准确度。鉴于生物样本因生理性波动等原因存在异质性,个别样本点落在圈外。

图2 16种目标氨基酸的特征质谱图Fig. 2 Typical mass spectra of the 16 target amino acids* Quantitative ion.

图3 血清样本的(a)PCA、(b)OPLS-DA得分图和(c)T预测散点图Fig. 3 (a) Principal component analysis (PCA), (b) orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) score plots , and (c)T-predicted scatter plot of the serum samples

2.5 潜在生物标志物筛选

采用两样本t检验,比较病例组和对照组中14种目标氨基酸的含量,结合VIP>1和p<0.05两个条件,筛选出5种差异氨基酸,即Glu、Ser、Asp、Gly和Try,其ROC曲线下面积(AUC)值均大于0.5,差异氨基酸水平在病例组中均明显下调(见图4)。

图4 差异氨基酸在病例组(红色)和对照组(蓝色)中含量的箱形图Fig. 4 Box charts of differential amino acids between disease group (red) and control group (blue)

其中,Ser的ROC曲线上最佳诊断点的灵敏度和特异性分别为94.6%和66.2%, AUC值为0.819;相对于其他目标氨基酸而言,Ser显示出较高的诊断准确性,使其有望成为尿石症的灵敏筛查指标。进一步将Glu、Ser、Asp、Gly和Try联合成为一个标志物组,利用逻辑回归分析结合ROC曲线评价该联合指标,灵敏度和特异性分别为97.3%和67.5%, AUC值达0.822(见图5),较单个Ser效果更令人满意;提示5种氨基酸的联合使用具有极强的尿石症筛查能力。

图5 5种差异氨基酸联合的ROC曲线Fig. 5 Receiver operator characteristic (ROC) curve of the five differential amino acids by integratingAUC: area under the curve.

2.6 差异氨基酸与尿石症的相关性分析

本研究采用GC-MS检测平台,利用尿石症患者和健康体检者的血清样本构建氨基酸代谢谱,发现病例组血清氨基酸代谢与对照组存在差异。经方法学考察及统计学分析后,最终筛选出5种差异氨基酸:Glu、Ser、Asp、Gly和Try。

Glu和Asp均为酸性氨基酸,在草酸钙晶体的发展过程中具有重要作用。草酸钙结石是尿路结石中最为常见的类型[28],多项研究表明,草酸钙晶体能够损伤肾小管上皮细胞[29-31]。Glu和Asp能够影响草酸钙晶体成核,抑制晶体生长和聚集,修复晶体对肾细胞损伤[32]。人体具有自我调节功能,患者若存在细胞损伤,则会利用Glu和Asp修复损伤,使其含量因消耗而下降,故在本研究中观察到病例组Glu和Asp含量均显著下调。Glu和Asp的AUC均大于0.7,提示这两种氨基酸与疾病进展密切相关,其含量下降程度可反映细胞受损程度。

Ser和Gly能够相互转化,并与结石的成因紧密相关。一方面,Ser可合成嘌呤前体,而嘌呤的最终产物为尿酸。Kuta等[33]研究证实结石患者平均血清尿酸水平高于非结石患者;沈欣[34]利用化学和红外线两种方法对200例尿路结石进行化学成分分析,认为血清尿酸水平与草酸钙结石和尿酸结石的形成有关,尿酸水平的升高是尿结石潜在风险因素之一。另一方面,Gly是合成草酸的原料之一,参与草酸钙结石的形成[11]。Ser和Gly作为结石晶体的合成原料,在尿石症患者体内因消耗而含量下降。本研究病例组Ser和Gly含量均明显减少,提示患者体内可能处于高尿酸状态,并存在结石晶体形成。Ser的AUC值高达0.819,有望成为临床上快速早诊的灵敏指标。

Try是人体内重要的必需氨基酸[35]。Gao等[14]构建的草酸钙结晶肾损伤小鼠模型中,尿液中Try含量上升,推测由于患者病情加重致肾损伤而使Try滤过增加,血清中Try含量因此下降。Gao等[36]的另一研究发现在草酸钙结晶肾损伤大鼠模型中,血清犬尿氨酸(Kyn)含量下降;并且,Try主要代谢转化为Kyn,故血清Try含量下降可致Kyn减少。本研究中病例组Try含量显著降低,提示尿石症患者机体可能存在实质性肾损伤。

图6 潜在生物标志物的代谢通路图Fig. 6 Metabolic pathways of potential biomarkers TCA: tricarboxylic acid; acetyl-CoA: acetyl coenzyme A.

Glu、Ser、Asp、Gly和Try均为生糖氨基酸,与体内糖酵解、三羧酸(TCA)循环、糖异生和氨基酸代谢密切相关(见图6)。Gly在羟甲基转移酶作用下与Ser相互转化,Ser的前体来自糖酵解途径中的3-磷酸甘油酸,后者先后经磷酸甘油酸变位酶和烯醇化酶催化产生磷酸烯醇式丙酮酸。磷酸烯醇式丙酮酸经以下两种方式转化为TCA循环的起始物质乙酰辅酶A:一方面合成Try,后者经代谢转化生成乙酰辅酶A;另一方面经糖酵解途径生成丙酮酸,后者在丙酮酸脱氢酶复合体作用下转化为乙酰辅酶A。TCA循环中α-酮戊二酸与氨基结合生成Glu,参与氨基酸代谢途径。TCA循环中草酰乙酸在转氨酶作用下,与Asp实现相互转化。同时,草酰乙酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶作用下,生成磷酸烯醇式丙酮酸,进一步转化为3-磷酸甘油酸进入糖异生途径。这5种氨基酸含量下降,提示患者体内糖酵解、TCA循环、糖异生和氨基酸代谢多条代谢途径出现异常。

3 结论

尿石症作为高发病率和高复发率的泌尿系统疾病,严重影响患者的生活质量,但其早期诊断和提早治疗尤为困难。本研究运用GC-MS平台和代谢组学策略分析尿石症血清氨基酸代谢谱,筛选出Ser等5种具有临床诊断能力的潜在生物标志物,展示了氨基酸代谢谱在筛选尿石症潜在生物标志物方面的应用前景,拓展了基于GC-MS技术的代谢组学平台的应用范畴,有望通过包括氨基酸在内的代谢物群组成为疾病标志物,以辅助临床进行疾病的早期诊断。