超高效液相色谱-大气压化学电离-三重四极杆质谱法同时测定血浆、尿液和瓜果类蔬菜中葫芦素B、E和I

张晓艺, 张秀尧, 蔡欣欣, 李瑞芬

(温州市疾病预防控制中心, 浙江 温州 325001)

人们喜爱的瓜果类蔬菜,如葫芦瓜(瓠瓜、蒲瓜)、丝瓜、南瓜、甜瓜、黄瓜、西瓜、香瓜、小胡瓜(zucchini)、冬南瓜(winter squash)等都属于葫芦科(Cucurbitaceae)南瓜属(CucurbitaLinn.)植物的果实,正常时无苦味,但有的有苦味,苦味瓜果的外形与正常瓜果无区别,只有在食用时才能发现,食用后会引起中毒[1-10],中毒时会出现恶心、呕吐、腹泻以及腹痛等症状,严重时可引起脱水、低血压、呕血、便血、心跳加速、头痛以及眩晕,甚至于肺水肿,偶尔还会引起脱发,国外称之为毒性南瓜属综合征。引起中毒的物质,有认为是糖甙生物碱[3],也有认为是葫芦素类物质[1,4,7-10]。葫芦素类物质属四环三萜类化合物,主要有葫芦素B (CuB)、葫芦素E(CuE)和葫芦素I (CuI)等[11],其化学结构见图1。葫芦素类味苦,具有一定的生理活性,具有抗氧化、抗肿瘤和护肝等作用,但也有一定毒性,葫芦素E会抑制丝切蛋白(cofilin)磷酸化,显示细胞毒性[12]。葫芦素B小鼠灌胃半数致死量(LD50)为(14.0±3.0) mg/(kg·bw),皮下给药的LD50为(1.00±0.07) mg/(kg·bw);葫芦素E小鼠灌胃的LD50为340 mg/(kg·bw),腹腔注射的LD50为2 mg/(kg·bw)[13]。3H-葫芦素B灌胃15 min后进入血液,4 h达到峰值,此时血浆蛋白结合率为88.7%,在肝、胆、胃内优势分布,在肺中含量高且持久,24 h内尿液和粪便中未见原形药物,胆汁含给药量的30.62%,并存在肝肠循环[14]。

图1 CuB、CuI、CuE和内标物夹竹桃甙的化学结构Fig. 1 Chemical structures of CuB, CuE, CuI and oleandrin (IS)

报道的葫芦素类检测方法有液相色谱法[15-18]和液相色谱-质谱法[19-21]。液相色谱法多用于测定药用植物中葫芦素类成分[15-17],也有用于葫芦素B注射剂在小鼠体内的药动学研究[18],但灵敏度低,定性能力差,无法满足中毒检测的要求。有液相色谱-质谱法用于葫芦素类药物的动力学研究,Zhao等[19]采用二氯甲烷萃取,反相色谱柱分离,在电喷雾电离、正离子模式下以CuB的[M+Na]+为母离子进行多反应监测(MRM)扫描,检测了大鼠血浆中葫芦素B的浓度;Fiori等[20]则采用乙腈蛋白沉淀法进行样品前处理,反相色谱法分离,在电喷雾电离、负离子、MRM模式下测定了大鼠血浆中CuI和CuE的浓度。也有采用液相色谱-串联质谱法测定小胡瓜中毒样品、患者血清和尿液等体液中CuB、CuI、CuE和CuE-葡萄糖甙的报道[21],样品采用二氯甲烷萃取,浓缩5倍后进样分析,经五氟苯基色谱柱分离,在电喷雾电离、负离子模式下采用选择离子监测(SIM)模式检测。

为了确定葫芦科南瓜属苦味瓜果中引起中毒的化学成分,本实验采用固相支持液液萃取法(SLE)提取和净化样品,超高效反相液相色谱法分离,建立了大气压化学电离、负离子模式、MRM方式的检测方法,用于引起中毒的苦味瓜果及患者血浆和尿液中CuB、CuE和CuI的测定,方法快速、灵敏、准确,用于实际中毒样品的测定,首次从引起中毒的苦味葫芦瓜及中毒患者的血浆和尿液中检出CuB。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪由ACQUITY UPLC BSM二元溶剂泵、FTN自动进样器和CM-A柱温箱组成(美国Waters公司); QTRAP 6500三重四极杆/复合线性离子阱串联质谱仪(美国AB Sciex公司); Ultra-Turrax T-25型分散机、MS3旋涡混旋器(德国IKA公司); 2510超声波清洗机(美国Branson公司); 3-30K高速冷冻离心机(德国Sigma公司); 24孔N-EVAP氮吹仪(美国Organomation公司); Gradient A10 Mill-Q超纯水器(法国Millipore公司)。

乙腈、甲醇和叔丁基甲醚(色谱纯,德国Merck公司); Cleanert SLE柱(1 000 mg/6 mL,天津博纳艾杰尔科技有限公司)。葫芦素B(纯度≥97%)、葫芦素E(纯度≥95%)和葫芦素I(纯度≥95%)标准物质购自美国Sigma公司;夹竹桃甙标准物质(纯度≥90%)购自加拿大TRC公司,临用时分别用甲醇溶解,配制成标准储备液、10.0 mg/L混合标准中间液和1.00 mg/L混合标准工作液,于-80 ℃保存。健康人血浆经浙江省卫生行政部门审批后由温州市中心血站提供,尿液由健康志愿者提供。

1.2 样品前处理方法

1.2.1血浆和尿液

在1.00 mL血浆或尿液中加入20 μL 0.10 μg/mL内标物夹竹桃甙,混匀,上样于SLE柱,放置5 min以上,用4.0 mL叔丁基甲醚洗脱,洗脱液于50 ℃水浴中氮气吹干,残渣溶于200 μL 50%(v/v)甲醇水溶液,过0.22 μm滤膜,待测。

1.2.2瓜果类蔬菜

切碎样品,均质后,称取2.00 g试样,置于50 mL具塞离心管中,加入10 mL乙腈,均质15 s,刀头用10 mL乙腈清洗,超声提取10 min,以10 000 r/min离心5 min,吸取上清液,残渣再用刀头清洗液重复提取1次,合并提取液,混匀,定容至20 mL,吸取500 μL提取液,置于5 mL试管中,加入500 μL甲醇和1 000 μL水,混匀,过0.22 μm滤膜,滤液待测。高浓度样品再用50%(v/v)甲醇水溶液稀释至合适浓度。

1.3 分析条件

1.3.1色谱条件

分析柱为XBridge BEH C18色谱柱(100 mm×3.0 mm, 2.5 μm),保护柱为Van Guard BEH C18保护柱(5 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱温45 ℃;流动相A:甲醇,流动相B: 0.025%(v/v)氨水溶液;流速:0.600 mL/min。梯度洗脱程序:0～3.5 min, 40%A～85%A; 3.5～3.6 min, 85%A～95%A; 3.6～5.5 min, 95%A; 5.5～5.6 min, 95%A～40%A; 5.6～7.5 min, 40%A。进样体积10 μL。

1.3.2质谱条件

离子源为大气压化学电离(APCI)源,负离子模式;扫描方式为MRM模式;离子源温度(TEM): 350 ℃;离子化电压(IS): -4 500 V;放电电流(NC): 5 μA;气帘气(CUR)压力:277 kPa;喷雾气(GS1)压力:414 kPa;碰撞气(CAD)强度:Medium。3种葫芦素和内标物的去簇电压分别为-60 V和-130 V。其他质谱参数见表1。

表 1 3种葫芦素和内标物的质谱参数

* Quantitative ion.

运行开始时,色谱柱流出液经六通切换阀切换至废液,2.70 min再切换到质谱离子源,质谱采集数据至3.60 min,六通切换阀又将柱流出液切换至废液中。

2 结果和讨论

2.1 质谱条件优化

实验发现CuB、CuE和CuI在电喷雾电离、正离子模式下可以形成较强的[M+Na]+峰,但以这些[M+Na]+峰作为母离子进行碰撞,得到的碎片离子强度很低且不稳定;而在电喷雾电离、负离子模式下可以形成[M-H]-、[M+HCOO]-和[M+Cl]-等离子,以这些离子作为母离子进行碰撞也无法得到稳定且有足够强度的碎片离子,若依据文献[21]选择这些离子进行SIM方式检测,对于实际样品,特别是血浆和尿液等基质复杂的样品,得到质谱信号的基线很高,灵敏度无法满足中毒样品低浓度检测的要求。尝试采用大气压化学电离模式对待测物进行优化,在正离子方式下电离,3种葫芦素类成分的[M+H]+峰强度较弱,但在负离子方式下电离,这些化合物的[M-H]-峰强度较强,以[M-H]-峰作为母离子进行碰撞能够得到稳定的碎片离子,且均有较强的脱水[M-H-H2O]-碎片峰,葫芦素B和葫芦素E还有[M-H-CH3COOH]-峰(见图2)。因此选择负离子大气压化学电离模式作为后续测定的质谱条件,再对离子化电压、放电电流、离子源温度、去簇电压、碰撞能量等参数进行优化,使得分子离子对的信号达到最强,选择信号最强的两对分子离子对,以响应相对较强的子离子作为定量离子,另一子离子作为定性离子。同时设定合适的峰驻留时间(dwell time)确保色谱峰的采样点数在15～20点,从而得到较好的定量重复性。

图2 CuB、CuE、CuI和内标物夹竹桃甙的子离子扫描质谱图Fig. 2 Daughter ion scan spectra of CuB, CuE, CuI and oleandrin (IS)

2.2 色谱条件优化

采用大气压化学电离源,液相色谱的流动相流速需≥0.6 mL/min,实验选择XBridge BEH C18色谱柱(100 mm×3.0 mm, 2.5 μm)作为分离柱,分别对甲醇-水和乙腈-水系统进行比较。结果显示,以甲醇-水系统作为流动相时,3种待测物有更高的响应值,因此选择甲醇-水系统进行后续优化。在甲醇-水系统中分别添加不同体积分数的甲酸(0.05%～0.30%)、氨水(0.010%～0.050%)和不同浓度的乙酸铵(1～5 mmol/L)。结果表明,流动相中加入甲酸和乙酸铵,3种待测物的质谱信号受到明显抑制,而加入氨水后质谱响应则有较大的增强,以甲醇-0.025%(v/v)氨水作为流动相时(见图3), 3种葫芦素类成分的质谱响应最强,故选作分离的流动相。然后再对流动相的流速、梯度洗脱条件、柱温等条件进行优化,3种待测物能够得到较好的分离(见图4)。

图3 流动相中氨水的体积分数对3种葫芦素质谱响应的影响Fig. 3 Effect of volume fractions of ammonia in mobile phases on the MS response of the three cucurbitacins

图4 3种葫芦素及内标物夹竹桃甙的UPLC-MS/MS色谱图Fig. 4 UPLC-MS/MS chromatograms of the three cucurbitacins and oleandrin (IS)

2.3 样品前处理方法优化

葫芦素类为四环三萜类化合物,脂溶性较强,对于血浆和尿液中的样品前处理方法,文献[20]采用乙腈沉淀法,文献[19,21]均采用二氯甲烷液液萃取法,考虑到乙腈沉淀法只能去除血浆中蛋白质等杂质,样品净化效果不理想,故本实验采用液液萃取法,考虑到传统的液液萃取法萃取效率比较低,易乳化,操作较为繁琐,而基于液液萃取法原理的固相支持液液萃取法具有萃取效率高、影响因素少和操作简单等优点,已应用于生物样品的前处理中[22,23],故选作样品净化的方法。

取1.00 mL血浆或尿液加标样品(5.0 μg/L)上SLE柱,然后分别用4.0 mL二氯甲烷、叔丁基甲醚和乙酸乙酯进行洗脱。结果显示,二氯甲烷和叔丁基甲醚洗脱液中3种待测物的质谱响应值均高于乙酸乙酯洗脱液,考虑到二氯甲烷为含氯试剂,不利于环境保护,且毒性较大,不予选用。因此最终选择叔丁基甲醚作为固相支持液液萃取法的洗脱溶液。

分别取6份1.00 mL血浆和尿液的加标样品(5.0 μg/L)上SLE柱,分别用2.0、4.0和6.0 mL叔丁基甲醚进行洗脱,以6.0 mL的洗脱率为100%计。结果显示,4.0 mL叔丁基甲醚洗脱率约为98%,故选择4.0 mL叔丁基甲醚作为SLE萃取柱的洗脱剂,洗脱液经氮吹后残渣溶于200 μL 50%(v/v)甲醇水溶液,样品浓缩了5倍。6份不同来源的血浆和尿液经本法处理后测定,在相应的保留时间上未见干扰色谱峰。

由于引起中毒的瓜果类蔬菜样品中毒物浓度相对较高,故瓜果类蔬菜样品提取液稀释后直接测定。取葫芦瓜加标样品2.00 g(加标水平0.5 mg/kg),分别用20 mL甲醇或乙腈分2次提取,合并提取液,取500 μL提取液加入500 μL水,混匀,过0.22 μm滤膜后测定。结果显示,甲醇与乙腈的提取效果相近,但离心后甲醇提取液中样品残渣悬浮于提取液中,不方便提取液的移取,而乙腈作为提取液则无此缺点,而故选用乙腈作为样品的提取溶液。

取加标葫芦瓜样品2.00 g(加标水平0.5 mg/kg),分别用10 mL乙腈提取3次,以3次提取率之和为100%计。结果显示,前2次乙腈的提取率约为99%,故最终选择10 mL乙腈提取2次。此时样品稀释10倍,再用水稀释1倍,测定时约有30%的基质抑制效应,若将测定液再用50%(v/v)甲醇水溶液稀释1倍,测定时并无明显的基质效应(ME)。

2.4 内标物的选择

采用内标法定量可以校正待测物在样品前处理中的损失,可以校正质谱测定过程中的波动和基质效应等,从而得到更好的准确度和精密度,最理想的是采用稳定同位素内标法,但目前葫芦素类成分尚无商品化的同位素标记物,尝试采用能在大气压化学负离子模式下电离的氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素和夹竹桃甙作为内标物,结果显示，夹竹桃甙的保留时间和离子对的m/z与CuB、CuE和CuI相近,故选用夹竹桃甙作为血浆和尿液样品的内标物。

2.5 方法验证

2.5.1线性范围、检出限和定量限

血浆或尿液中待测物用基质加标标准曲线内标法定量,分别在6份各含1.00 mL空白血浆或尿液中加入适量混合标准工作溶液,使各待测物的质量浓度分别为0.1、0.3、1.0、2.0、5.0和10.0 μg/L,再分别按1.2.1节进行样品前处理和测定,采用MultiQuant定量软件进行数据处理,以目标化合物的定量离子对与内标物的峰面积比值(Y)对其对应的质量浓度(X, μg/L)进行线性回归(权重取1/X)。

瓜果类蔬菜样品采用溶剂标准曲线外标法定量,用50%(v/v)甲醇水溶液稀释混合标准工作溶液,使3种葫芦素的质量浓度分别为1.0、2.0、5.0、20.0、100和500 μg/L,进行检测,以目标化合物的定量离子对的峰面积(Y′)对其对应的质量浓度(X, μg/L)进行线性回归(权重取1/X)。

表 2 3种葫芦素的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

Y: the peak area ratio of the quantitative ion of analyte to internal standard (weight 1/X);Y′: the peak area of the quantitative ion of analyte (weight 1/X);X: mass concentration, μg/L; # μg/kg.

表 3 血浆、尿液和葫芦瓜中3种葫芦素的加标回收率和精密度(n=6)

# μg/kg.

血浆、尿液和瓜果类蔬菜中3种待测物的线性范围、线性方程和相关系数(r)见表2,相关系数均≥0.997 1,线性关系良好。在空白血浆和尿液样品中分别加入低浓度的待测物进行测定,以分子离子对的信噪比≥3和≥10时的样品浓度作为检出限(LOD)和定量限(LOQ),结果见表2。血浆和尿液中3种待测物的检出限均为0.03 μg/L,定量限均为0.1 μg/L,能够满足中毒检测的要求;瓜果类蔬菜中3种待测物的检出限为5～10 μg/kg,定量限为15～ 40 μg/kg。

2.5.2准确度和精密度

按欧洲药品管理局(EMEA)的要求在定量限、3倍定量限、中等浓度和高浓度下进行准确度和精密度试验[24],在血浆和尿液中加标3种葫芦素,使各待测物浓度分别为0.1、0.3、1.0和8.0 μg/L,葫芦瓜加标一定水平的待测物代表瓜果类蔬菜进行试验,加标水平为40、100、1 000和15 000 μg/kg,每个水平平行试验6次,一个工作日内进行测定,计算平均加标回收率和精密度。

3种待测物的加标回收率和精密度结果见表3。血浆和尿液的平均加标回收率为89.0%～113%,相对标准偏差为1.7%～12.2%,符合文献[24]要求;葫芦瓜样品的加标回收率为87.6%～114%,相对标准偏差为4.1%～11.1%。表明本法用于血浆、尿液和瓜果类蔬菜中3种毒物的检测具有较高的准确度和精密度。

2.5.3基质效应和提取回收率

基质效应通过基质标准曲线斜率/溶剂标准曲线斜率×100%进行评估。ME=100%表示无基质效应,ME>100%表示基质增强效应,ME<100%表示基质抑制效应[25]。

用50%(v/v)甲醇水溶液稀释3种葫芦素混合标准工作液,使其质量浓度分别为0.5、1.5、5.0、10.0、25.0和50.0 μg/L,制作溶剂标准曲线；取6份空白血浆和尿液样品，按1.2.1节进行样品前处理,加入3种葫芦素混合标准工作液，使血浆或尿液样品中3种葫芦素的质量浓度分别为0.1、0.3、1.0、2.0、5.0和10.0 μg/L,制作基质标准曲线,测定并计算ME值。血浆和尿液中3种葫芦素的ME值分别为147%～211%和133%～174%,显示有较强的基质增强效应,降低样品浓缩倍数至1或2倍,但基质增强效应并未减少。以葫芦瓜为代表对瓜果类蔬菜进行基质效应评估,3种葫芦素的ME值为92.4%～98.2%,显示无明显的基质效应。

图5 中毒患者血浆和尿液中CuB的色谱图Fig. 5 Chromatograms of CuB in the plasma and urine of poisoned patients

提取回收率则通过计算基质加标标准曲线与相同浓度的基质标准曲线的斜率之比值再乘以100%来确定[25]。在6份空白血浆和尿液中添加3种葫芦素混合标准工作液,使其质量浓度分别为0.1、0.3、1.0、2.0、5.0和10.0 μg/L,按1.2.1节进行样品前处理,制作基质加标标准曲线,测定并计算提取回收率,血浆和尿液中3种葫芦素的提取回收率分别为64.6%～74.8%和66.8%～81.9%。瓜果类蔬菜以葫芦瓜为代表进行提取回收率计算,3种葫芦素的提取回收率约为94.3%～99.1%。

虽然经过样品前处理净化,血浆和尿液中3种葫芦素还显示一定的基质增强效应,但通过基质加标标准曲线内标法进行定量,校正样品的基质效应和提取回收的不完全,使最终得到满意结果,符合中毒样品快速检测的要求。

2.5.4稳定性试验

样品提取液在自动进样器样品盘上室温放置72 h,每间隔24 h测定1次,3种待测物的含量变化均≤9.6%,表明没有明显的降解。

2.6 实际样品的测定

2017年3月24日,广西某小学有14名学生食用苦味葫芦瓜炒肉片后出现恶心、腹泻等症状。采用本法检测苦味葫芦瓜片(熟)样品,从中检出CuB,含量为0.94 mg/kg。

2019年6月21日,浙江省台州市某工厂职工在食堂就餐时食用了苦味葫芦瓜炒肉片,有30多人发病,出现恶心、呕吐、腹泻以及腹痛等症状。次日收到样品,采用本法从葫芦瓜片(熟)样品中检出CuB,含量为2.15 mg/kg,从瓜皮中也检出CuB,含量为0.068 mg/kg; 24份血浆样品中有4份检出CuB,含量为0.05～0.07 μg/L; 21份尿液样品中有20份检出CuB,含量为0.15～1.20 μg/L,中位数为0.35 μg/L,所有样品均未检出CuE和CuI。血浆和尿液阳性样品的MRM色谱图见图5。

检测了18份市售瓜果类蔬菜样品,其中葫芦瓜5份、丝瓜3份、黄瓜3份、南瓜3份、冬瓜3份和苦瓜1份,有1份葫芦瓜样品检出葫芦素B,含量为0.10 mg/kg,其余均未检出。

3 结论

本文结合食物中毒检测的特点以及3种葫芦素的化学性质,采用固相支持液液萃取法作为血浆和尿液的样品前处理方法进行开发,瓜果类蔬菜采用乙腈提取,再用溶剂稀释,通过对超高效液相色谱与质谱检测条件的优化,得到了较高的检测灵敏度。方法学验证结果表明,该法具有简便、快速、灵敏、准确等优点,满足食物中毒检测的要求,应用于实际样品的检测取得了满意结果。本法适用于血浆、尿液和瓜果类蔬菜中3种葫芦素类成分的同时快速检测。