利用在线加压溶剂提取-超高效液相色谱-离子肼-飞行时间-质谱法直接分析中药草苁蓉的化学成分组

李 婷, 许 霞, 常安琪, 刘文静, 宋青青*, 宋月林,2*, 屠鹏飞

(1. 北京中医药大学中药学院中药现代研究中心, 北京 100029;2. 中药品质评价北京市重点实验室, 北京 100029)

草苁蓉又名不老草,为列当科草苁蓉属一年寄生草本植物BoschniakiarossicaFedtschetFlerov的干燥全草,多寄生于桦木科赤杨属植物Alnus的根上[1]。草苁蓉全草入药,味甘、咸,性温,具补肾壮阳、润肠通便等功效,主治肾虚阳痿、腰膝冷痛、肠燥便秘等证[2]。现代药理研究表明,草苁蓉总提物及其有效部位具有保肝、抗炎、抗肿瘤、抗氧化及清除自由基、提高免疫及增强记忆力等多种药理作用[3-9]。目前,前人已从草苁蓉属植物中分离并鉴定了120余个化合物,主要为苯丙醇苷类、环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类、三萜类、单萜类、生物碱类、甾体等[2,10]。然而,草苁蓉的化学成分组尚未被深入阐明。鉴于中药多成分、多靶点、多途径的作用特点,全面表征中药化学成分组,解析中药的复杂化学物质组,是阐明中药药效物质的基础环节,更是保障中药质量以及临床安全有效的关键。因此,本文通过建立快速、可靠的分析方法,对草苁蓉化学成分组进行表征,以期为草苁蓉的质量控制以及深度利用开发提供有效信息。

传统的中药提取技术主要有回流法、浸入法、超声波提取法和索氏提取法等,然而,这些提取方法需要消耗大量的样品和有机试剂,且提取过程中不稳定化合物在有机试剂和光照下易发生降解或异构化[11]。本课题组[12-14]前期成功构建了在线加压溶剂提取模块(online PLE):将微量样品置于预柱套的柱芯中,以水作为提取溶剂,通过柱温箱提供高温以及高效液相色谱系统加压的方式,实现了样品的高效提取。该方法能够减少有机溶剂和样品的使用量,缩短提取时间,践行了“绿色分析化学”的理念[15-17]。高分辨质谱仪如IT-TOF-MS、Q-TOF-MS、LTQ-Orbitrap-MS等拥有分辨率高的特点,其与液相色谱系统联用已被广泛应用于中药化学成分表征研究。本研究通过在线加压溶剂提取模块在线耦连超高效液相色谱-离子肼-飞行时间质谱(online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS),快速、直接表征草苁蓉的化学成分组。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

岛津UHPLC-IT-TOF-MS液质联用仪(包括2台LC-20ADXR泵、SIL-20AC自动进样器、CTO-20A柱温箱、SPD-M20A紫外检测器、DGU-20A脱气机、CBM-20A控制器、IT-TOF MS质谱仪,日本岛津公司), Milli-Q超纯水净化系统(美国Millipore公司); Mettler ME204型电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司),超声波清洗器(南京垒君达超声电子设备有限公司), Phenomenex cartridge柱芯(3.0 mm×4.0 mm,货号:AJ0-4287,飞诺美公司)去除C18填料,Phenomenex Security GuardTM预柱套(货号:KJ0-4282,飞诺美公司)。

肉苁蓉苷A(CAS No. 93236-42-1,纯度98%)和毛蕊花糖苷(CAS No. 61276-17-3,纯度98%)均购自上海源叶生物科技有限公司。色谱级和质谱级甲醇、乙腈以及质谱级甲酸均购自美国Thermo Fisher公司,水为实验室自制,其余试剂均为分析纯。

草苁蓉药材于2018年9月采自黑龙江省大兴安岭区,经北京大学屠鹏飞教授鉴定为列当科植物草苁蓉BoschniakiarossicaFedtschetFlerov的干燥全草。标本存放于北京中医药大学中药学院中药现代研究中心。

1.2 online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS条件

1.2.1提取

草苁蓉药材在40 ℃烘箱中干燥3天,粉碎,过24目筛。精密称取0.5 mg草苁蓉粉末,置于空预柱芯内,并称取15 mg正相硅胶填充预柱芯,之后两端用滤膜密封,构成在线提取池(vessel)。将其装入适配的预柱套,放入70 ℃柱温箱中。提取溶剂为0.1%(v/v)甲酸水(流动相A),流速为0.2 mL/min,提取时间为3 min。提取液通过一根650 mm的金属管线(0.13 mm i. d.)引入色谱柱,该管线置于柱温箱外以确保提取液温度快速降至室温。online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS系统提取过程示意图如图1a所示,整个提取过程通过进样2 μL 0.1%(v/v)甲酸水自动触发。在提取阶段,六通阀处于6-1位连接,流动相A作为提取溶剂在高温高压条件下直接提取样品,各化学成分(主要为中、小极性化合物)富集于反相色谱柱前端。

图1 在线加压提取-超高效液相色谱-离子肼-飞行时间质谱系统示意图Fig. 1 Schematic diagrams of the online pressurized liquid extraction-ultrahigh-performance liquid chromatography-ion trap-time of flight mass spectrometry (online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS) system a. extraction; b. elution.

1.2.2液相色谱条件

Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm,美国Waters公司)置于室温下,流速0.2 mL/min, PDA检测波长254 nm。流动相A为0.1%(v/v)甲酸水,流动相B为0.1%(v/v)甲酸乙腈。梯度洗脱程序:0～3 min, 0%B; 3～6 min, 0%B～4%B; 6～9 min, 4%B; 9～10 min, 4%B～18%B; 10～40 min, 18%B～35%B; 40～45 min, 35%B～55%B; 45～45.1 min, 55%B～0%B; 45.1～55 min, 0%B。在提取3 min后,online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS系统流路示意图见图1b。六通阀切换至1-2位连接,提取池未接入整个流路,流动相直接泵入色谱柱,将色谱柱前端富集的化学成分梯度洗脱。

1.2.3质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,扫描模式:负离子模式并自动触发多级质谱。MS1的扫描范围为m/z100～1 000; MS2的扫描范围为m/z50～1 000,碰撞诱导解离(CID)能量为70%; MS3的扫描范围为m/z50～800,碰撞诱导解离(CID)能量为60%。喷雾室电压为-3.5 kV;雾化气(N2)流量为1.5 L/min;干燥气体压力为100 MPa;检测电压为1.6 kV;曲型脱溶剂管(CDL)和加热模块温度均为200 ℃。碰撞室压力为2.0×10-4Pa;离子肼压力为3.0×10-2Pa;各级质谱的重复次数为3,离子累积时间为10 ms。

1.3 标准品溶液制备与分析

精密称取适量肉苁蓉苷A和毛蕊花糖苷标准品,分别溶于甲醇中,配成10 mmol/L的储备液。精密吸取各储备液适量,用50%(v/v)甲醇水溶液稀释100倍,制成混合标准品溶液。预柱芯用正相硅胶填充,其余项同1.2节,自动进样器吸取2 μL混合标准品溶液进行分析。

1.4 超声提取与分析

1.4.1供试品溶液的制备

取1 g草苁蓉粉末,加入10 mL 50%(v/v)甲醇水溶液,超声30 min,以12 000 r/min转速离心10 min,取上清液,经0.25 μm微孔滤膜过滤后,取续滤液作为供试品溶液。

1.4.2液相条件

实验装置与图1b一致。色谱柱、流动相及流速同1.2.2节。梯度洗脱程序:0～3 min, 0%B～4%B; 3～6 min, 4%B; 6～7 min, 4%B～18%B; 7～37 min, 18%B～35%B; 37～42 min, 35%B～55%B; 42～42.1 min, 55%B～4%B; 42.1～52 min, 0%B。进样体积5 μL,柱温为室温,PDA检测波长254 nm。质谱条件同1.2.3节。

2 结果与讨论

2.1 在线加压溶剂提取条件的优化

在本课题组前期建立的在线加压溶剂提取模块的基础上进一步优化。首先对色谱柱进行了考察,最终选择Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱,并以乙腈-水系统作为流动相,提高色谱峰分离度。进一步优化了流动相中甲酸体积分数(0%、0.05%、0.1%甲酸水,以及0%、0.05%、0.1%甲酸乙腈)、金属管线长度(550、650、750、850和1 000 mm)、提取温度(50、60和70 ℃)、提取时间(2、3和4 min)和提取流速(0.15、0.2和0.3 mL/min)。基于色谱峰形和整体响应的考虑,最终选择0.1%甲酸为流动相A和B的添加剂。而管线长度、提取温度、提取时间和提取流速的优化值分别为650 mm、70 ℃、3 min和0.2 mL/min。在提取过程中,金属管线和T3色谱柱为提取池提供约25 MPa压力,实现了高温、高压提取。管线长度增长时系统压力无明显变化,为了将提取液降至室温,最终选择的金属管线长度为650 mm。实验发现,提取时间和流速的增加并没有增大峰的容量和响应,而0.2 mL/min、3 min即可实现与超声提取方法相似的提取效率,达到较完全的提取。绝大部分中、小极性化合物在提取过程中富集在色谱柱柱头,在洗脱过程开始后才出峰,因此3 min提取时间并不会对色谱分离产生显著影响。

图2 负离子模式下草苁蓉的基峰色谱图Fig. 2 Base peak chromatograms of Boschniakia rossica in negative ion modea. pressurized liquid extraction; b. ultrasonic extraction.

2.2 在线加压溶剂提取法与超声提取法的比较

在对应生药量一致的情况下,对比草苁蓉在线加压溶剂提取的基峰色谱图(见图2a)和超声提取的基峰色谱图(见图2b),发现二者谱图轮廓基本一致。此外,对不同保留时间范围内的主要色谱峰(2、3、4、6、8、9、14、17、21、22、23、35、37、38、42、43、44、45、46、47和48)进行指认,两者化学成分组信息基本相同。加压溶剂提取的色谱峰整体响应值高于超声提取。在线加压溶剂提取法所需的样品量少,提取时间短,提取效率高,可用于草苁蓉化学成分组的直接、快速分析。并且,以水作为提取溶剂,符合“绿色分析化学”的理念。

2.3 草苁蓉化学成分组的表征

利用建立的online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS采集中药草苁蓉在负离子模式下的MS1、MS2和MS3质谱信息,其中MS1基峰色谱图(BPC)如图2a所示。从草苁蓉中检测到48个化合物(见表1),初步鉴定了其中的45个化学成分,包括10个苯乙醇苷类(phenylethanoid glycosides, PheGs)、14个环烯醚萜苷类(iridoids)以及21个苯丙醇苷类(phenylpropanoid glycosides, PhpGs)化合物。通过对照品指认2个化合物(21和30);通过文献比对[2,10,18-29]、ChemSpider和Pubmed等数据库以及质谱裂解规律推导,初步鉴定了43个化合物;其余3个化合物(46、47和48)由于质谱信息和参考文献不足,暂无法准确鉴定其结构。

2.4 各类化合物鉴定及质谱裂解规律的推导

2.4.1苯乙醇苷类的质谱裂解规律及结构鉴定

从草苁蓉中共鉴定10个苯乙醇苷类化合物(见表1),其中2个通过对照品指认(21和30), 5个是前人已从草苁蓉中分离得到的(15、16、28、32和34), 3个根据裂解规律及特征碎片推导(3、31和43)。以化合物28(保留时间tR=18.582 min)为例,阐述苯乙醇苷类化合物的质谱裂解规律及其结构鉴定过程。在负离子模式下,化合物28准分子离子峰[M-H]-为m/z785.248 4(C35H46O20,误差-3.31×106,即-3.31 ppm)。在MS2图谱(见图3a)中的主要碎片为m/z623.210 3 [M-H-C9H6O3]-和m/z461.161 7 [M-H-C9H6O3-C6H10O5]-,提示该化合物会连续失去咖啡酰基(162.03 Da)和葡萄糖残基(162.05 Da)。MS3图谱(见图3b)中的是由m/z623.210 3产生的碎片m/z461.167 5、443.155 5和315.104 5,说明m/z623.210 3失去葡萄糖残基(162.05Da)生成m/z461.161 7,进一步发生糖苷键断裂失去鼠李糖残基(146.05 Da)生成m/z315.104 5。该化合物的预测分子式和碎片信息均与草苁蓉苷A一致[18],故推测该化合物为草苁蓉苷A,其主要裂解途径如图3c所示。

由表1数据结合文献报道[11],在负离子模式下,苯乙醇苷类化合物易产生准分子离子峰[M-H]-或加合离子峰[M-HCOO]-,进而通过糖苷键断裂丢失葡萄糖基残基(162.05 Da)或鼠李糖残基(146.05 Da),以及酯键断裂丢失咖啡酰基(162.03 Da),也常发生中性丢失水分子(18.00 Da)。

2.4.2环烯醚萜苷类的质谱裂解规律

从草苁蓉中共鉴定14个环烯醚萜苷类化合物,其中5个是前人已从草苁蓉中分离得到的(22、23、24、26和27),其余9个通过特征碎片和质谱裂解规律推导(1、2、4、14、17、18、20、25和29)。以化合物23(tR=16.932 min)为例,阐述该类化合物的质谱裂解规律及解析过程。负离子模式下,其准分子离子峰m/z359.134 5 [M-H]-(预测分子式C16H24O9,误差0.28 ppm); MS2图谱(见图4a)中的主要碎片离子为m/z197.084 6 [M-H-C6H10O5]-、153.094 4 [M-H-C6H10O5-CO2]-、135.083 1 [M-H-C6H10O5-CO2-H2O]-,分别由母离子连续失去162.05 Da(C6H10O5)、44.00 Da(CO2)、18.00 Da(H2O)而得,推测其结构中含有葡萄糖、羧基和羟基。对比发现,化合物23的预测分子式和碎片信息均与7-deoxy-8-epiloganic acid相符[22],可能的裂解途径如图4b所示。

图3 草苁蓉苷A的质谱图和质谱裂解途径Fig. 3 Mass spectrum and proposed mass fragmentation pathways of rossicaside A a. MS2 spectrum; b. MS3 spectrum; c mass fragmentation pathways.

由表1数据结合文献数据[11],负离子模式下,环烯醚萜苷类化合物易产生准分子离子峰[M-H]-或加合离子峰[M-HCOO]-,进而发生糖苷键断裂丢失葡萄糖残基(162.05 Da),环烯醚萜母核上如有羧基取代会丢失CO2(44.00 Da)。

2.4.3苯丙醇苷类的质谱裂解规律

图5 草苁蓉苷B的质谱图和质谱裂解途径Fig. 5 Mass spectrum and proposed mass fragmentation pathways of rossicaside Ba. MS2 spectrum; b. MS3 spectrum; c. the proposed mass fragmentation pathways.

从草苁蓉中共鉴定21个苯丙醇苷类化合物,其中14个是前人已从草苁蓉中分离得到的(6、9、10、11、12、33、35、36、37、38、39、40、41和42), 7个(5、7、8、13、19、44、和45)根据质谱裂解规律及特征碎片推导。以化合物37(tR=24.368 min,见图5)为例,阐述其解析过程以及苯丙醇苷类化合物的质谱裂解规律。在负离子模式下,准分子离子峰[M-H]-为m/z781.256 1(预测分子式C36H46O19,误差0 ppm)。在MS2图谱中(见图5a)的主要碎片为m/z649.199 9 [M-H-C9H8O]-、505.161 2 [M-H-C9H8O-C6H10O5+H2O]-、487.141 7 [M-H-C9H8O-C6H10O5]-和323.093 3 [M-H-C9H8O-C6H10O5-C6H10O4-H2O]-,提示该化合物会连续失去132.05 Da(C9H8O)、162.05 Da(C6H10O5)、146.05 Da(C6H10O4)和18.00 Da(H2O),推测其结构中含有对羟基苯丙烯醇、葡萄糖、鼠李糖和羟基等结构片段。MS3图谱中(见图5b)是由m/z649.199 9产生的碎片m/z505.161 2、487.141 7、323.093 3和305.063 6,推测m/z305.063 6为m/z323.093 3丢失18.00 Da(H2O)产生。推断其主要裂解途径如图5c所示。比对文献[19],该化合物的预测分子式和碎片信息与草苁蓉苷B和I一致。但草苁蓉苷B和I为同分异构体,两者区别仅是肉桂酰基取代位置不同。草苁蓉苷B结构中,咖啡酰基位于与苷元相连的第一个葡萄糖的4位羟基,而草苁蓉苷I则取代于相同糖基的6位羟基,无法通过IT-TOF-MS区分二者。

由表1数据结合文献报道[2],负离子模式下,苯丙醇苷类易产生准分子离子峰[M-H]-,主要裂解途径包括醚键断裂丢失苯丙醇苷元对羟基苯丙烯醇(132.05 Da)、糖苷键断裂丢失葡萄糖残基(162.05 Da)或鼠李糖残基(146.05 Da)以及酯键断裂丢失酰基(主要为咖啡酰基162.03 Da)。

3 结论

相比传统中药样品的提取方法,本文所构建的在线加压溶剂提取法所需样品及溶剂少、提取时间短、效率高,不仅能够直接与高效液相色谱串联,实现直接快速分析,同时也避免了不稳定化合物在提取过程中发生降解的可能性,提高了化学成分分析的准确性。本文同时利用高分辨质谱采集了多级准确质谱信息,总结了草苁蓉中苯乙醇苷类、环烯醚萜苷类和苯丙醇苷类等化学类型的质谱裂解规律。进而,利用online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS系统从草苁蓉中检测到48个化合物,初步鉴定45个化合物,包括10个苯乙醇苷类、14个环烯醚萜苷类以及21个苯丙醇苷类化合物,实现了草苁蓉化学成分的快速、直接分析,为草苁蓉化学成分、质量评价以及药效物质研究提供可靠的方法和有效数据,也为其他中药的快速、直接化学成分分析提供了可行的方案。